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河魨毒及麻痺性貝毒:河魨毒的檢測

河魨毒是一種神經毒素,廣泛存在於水產動物中,為了水產品的食用安全,檢測樣品中是否含有河魨毒極為重要。
 
 
 
海洋生物毒廣泛存在於海洋動物中,而常造成食物中毒的主要是河魨毒、麻痺性貝毒、熱帶海魚毒、下痢性貝毒等,因此普遍受到世界各國學者專家的關注。在海洋生物毒中,以水產毒素河魨毒和麻痺性貝毒最常見。河魨毒最早發現存在於河魨中,並命名為tetrodotoxin,目前已知河魨毒廣泛存在於河魨類、蝦虎類、織紋螺類、玉螺類、榧螺類、扁蟹類、二枚貝類、海星類等水產動物中。

在國內,河魨毒常引起食物中毒而導致死亡事件,因此甚被重視。河魨毒是一種神經毒,中毒症狀是噁心、嘔吐、麻木刺痛(包括口、舌和四肢)、頭暈無力、具飄浮感、運動失調、吞嚥困難。嚴重個案甚至出現呼吸麻痺、低血壓、心跳減慢等現象,潛伏期長短受進食毒素量的影響。中毒後,若能支撐超過18~24小時,通常預後良好。為了水產品的食用安全性,檢測樣品中是否含有河魨毒極為重要,以下說明檢測河魨毒的方法。

檢測技術

小白鼠生物毒性檢定法 測量檢體的體重、體長後,即刻解剖中腸腺和可食部分。樣品加入等體積醋酸溶液並均質化後,以沸水水浴加熱10分鐘,萃取出粗毒溶液,並稀釋成不同倍數的溶液。再以腹腔注射方式把1毫升溶液打入4周齡18~20克的ICR系雄性小白鼠,觀察其中毒特徵,例如舉尾、抽筋、圈狀運動和呼吸困難,並記錄其死亡時間和稀釋倍數,以對照河魨毒生物檢定表計算毒性。

毒性單位是老鼠單位,一個老鼠單位是指在30分鐘可殺死20克雄性小白鼠的毒劑量。比較粗毒溶液各稀釋濃度對死亡時間作圖的曲線與標準品河魨毒的曲線,當兩條曲線重合或平行時,可得知粗毒溶液中可能含有河魨毒。因此把患者所吃的殘餘檢體依上述方法測其毒性,就可得知檢體中每公克具有多少老鼠單位的河魨毒毒性。

薄層色譜分析法 薄層色譜分析法是一種能把不同物質分離和鑑定化學成分的方法,它的成本較其他方法低,已廣泛應用在醫藥化學分析中。

薄層色譜分析的基本配備是展開槽、槽蓋、薄層板和溶劑。放進薄層以前,先把4啶:乙酸乙酯:醋酸:水(15:5:3:4)溶劑系統加入,並使槽密閉,以使槽內有飽和的溶劑蒸氣。離薄層底部2公分處,以鉛筆劃線,並把標準品和樣品點上去,使其浸入溶劑中。溶劑因毛細作用而被吸上去,樣品裡的各成分便以不同速率向上移,最後檢驗斑點。以氫氧化鉀噴霧後在攝氏110度下加熱5分鐘,在365 nm紫外光下可觀察到黃色(河魨毒)和藍色(脫水河魨毒)的螢光。

這項方法的優點是操作所需時間短,分離後各成分可回收供定量及定性的分析,缺點是靈敏度不高。

電泳法 每一種物質組成的成分大都帶有電荷,而電泳是利用電流來移動分子,依其移動距離而判斷出分子種類的方法。醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜為擔體,以鹼性緩衝液使河魨毒略帶正電,利用電流使它與其他物質分離。另把氫氧化鉀噴灑在完成泳動的電泳片上,並加熱反應10分鐘 ,可呈現與薄層分析法同樣的螢光。

高效能液相層析法 高效能液相層析目前已廣泛使用於各種化學物質的純化、定性和定量分析上。層析法是利用樣品在兩相(固定相和移動相)間的極性、吸附性的不同而達到分離效果。本系統是由逆向層析管、反應液的高壓幫浦、恆溫箱、反應蛇管和螢光偵測器組成,以含有界面活性劑的磷酸緩衝液沖洗C18管柱的非極性層析管使河魨毒分離,溶出液再混合強鹼並加熱使河魨毒形成C9鹼基,便可利用吸收波長381 nm,放射波長505 nm的螢光偵測器加以測定。

氣相層析質譜法 層析過程中的流動相若是氣體,就是所謂的氣體層析法。河魨毒在強鹼下加熱形成C9鹼基後,把pH調至3~5之間,以正丁醇萃取並濃縮。加入二甲基矽烷,可在C9鹼基的氨基和氫氧官能基上形成二甲基衍生物C9H6O2N3(TMS)3,分子量是407。以非極性的氣相層析管柱分離後,可在質譜儀上偵測出親體407(M),主要波峰392(M-CH)、376(M-C2H)、334(M-SiC3H9)、320(M-NSiC3H9)及318(M-OSiC3H9)。由破碎分子的強度和分子量可鑑定該分子的結構與種類。

液相層析質譜法 層析過程中的流動相若是液體,就是所謂的液體層析法。以液相層析質譜儀進行分析工作,不僅可以避免使用氣相層析質譜儀時必須進行的衍生化過程,同時可以針對不同極性範圍的物質進行分析。這個方法能使待測物在移動相中解離成帶電荷的離子,或與質子結合成帶電荷的離子,產生的離子經質譜儀的分析可以得知離子的質量和電荷比,針對河魨毒可精確測得分子量和質譜斷裂碎片荷質比。

紫外光吸收光譜法 紫外光吸收光譜掃描是測定分子吸收光能後,價電子因能階躍升而產生的吸收光譜。河魨毒先以氫氧化鈉水解,在攝氏100度下加熱30分鐘,可形成C9鹼基化合物,這個化合物可做為河魨毒的定性分析樣品。取少量的毒成分,加熱冷卻後用紫外光吸收光譜儀掃描,在波長274 nm處有最大吸光值。

紅外線光譜法 利用紅外線光譜儀進行化合物的分析,是非破壞性分析方法中的一種,主要以分析有機成分為主。光譜的吸收帶隨各成分特有的官能基類別和濃度呈現不同的吸光值,可據以反推化合物種類和含量,達到定性與定量的分析目的,屬於間接的測定方法。河魨毒與溴化鉀粉末混合均勻後製成錠片,在紅外線光譜上掃描波數4,000至400之間,在波數3,350、3,240、1,670、1,612及1,075處有吸收波峰,可以鑑別河魨毒的化合物基團。

核磁共振分析法 核磁共振儀是把核磁共振現象應用於分子結構的測定。對於有機分子結構的測定,核磁共振儀扮演非常重要的角色。這項技術主要是用於得到能量轉移的波峰,進而鑑別河魨毒第4碳、第6碳或第11碳上氫的立體結構異構物。

酵素免疫分析法 由於河魨毒的分子量小,容易由體內排出,不易在老鼠體內形成抗體免疫反應。必須把河魨毒衍生化成無毒性的河魨酸,再以牛血清蛋白、無脊椎動物的血氰蛋白等大分子蛋白質,對老鼠進行抗體-抗原反應以製得單株抗體。利用製得的單株抗體可發展酵素免疫分析法,先把河魨毒固定在平板底部,再加入河魨毒抗體,最後加入已標識酵素的抗老鼠抗原的抗體就可呈色觀察。它的優點是方便、快速及靈敏度高,且檢測樣品不需經多次純化步驟。

組織培養法 以老鼠神經細胞取代小白鼠,利用神經細胞死亡後懸浮於溶液上計算存活率,可用以定量測定河魨毒的濃度。另以細胞染色用的染劑染色已死亡神經細胞,在540 nm波長下計算神經細胞的存活率,可定量測定神經毒的濃度。

生物體中河魨毒的檢測,目前仍以使用小白鼠的生物毒性檢測方法最為簡便。在定性及定量的檢測上,則以高效能液相層析法和液相層析質譜法最常使用。然而保護動物的觀念越來越被重視,發展簡易的細胞毒性檢測方法和酵素免疫測定法是急需研發的項目。
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