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有毒的海洋生物:以基因體辨別有毒魚種

加工製品會因加工或加熱導致外觀特徵的去除,使原料物種的判別變得困難,這一困擾可利用基因體辨識來解決。
 
 
 
 鑑別物種的方法

棲息在水中的動物物種甚多,其中鑑定有毒的也不少。把這些有毒的水中動物記錄分類,對確保民眾的安全有正面效果,一旦中毒,也可以快速提供正確的魚種和致毒物質,對治療很有幫助。鑑別物種的方法,早期是以骨骼學、肌肉學、歧支分類學、生活史特徵,甚至鰭特徵、鱗片、腸形等來區分魚種的親緣關係。隨著生物科技的進步,蛋白質及基因技術已廣泛應用在分類學的研究上,準確性也受到高度肯定。

蛋白質分類技術有硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳法、二維電泳法等。至於基因分類方法,有聚合酶連鎖反應-隨機放大多型性核苷酸法、直接定序分析比對法、聚合酶連鎖反應-限制片段長度多型性法等,都經常使用於新物種種別的鑑定。

加工製品會因加工或加熱導致外觀特徵的去除,使原料物種的判別變得困難,這一困擾可利用基因體辨識來解決。因為核酸在加熱過程中會發生裂解,但利用瓊酯凝膠電泳法分析裂解後核酸圖譜和種別特異性引子(primer)的增幅作用,以增幅極短基因片段,這方法在原料魚種鑑別上甚為普遍。

基因體的遺傳性質

大家也許都聽過「基因」這個名詞,它是遺傳特徵的基本單位。基因是由核苷酸構成的,而基因裡更蘊含著建構生物個體的遺傳訊息。就如電腦以「0」與「1」做為機器語言的密碼,在生物世界裡,是以A、T、G、C這4個英文字母的密碼,把遺傳訊息儲存在長鏈的核苷酸分子裡。然後,細胞再透過「轉譯機器」根據A、T、G、C的遺傳密碼製造出特定結構的蛋白質,以便執行複雜的生理功能。
 
DNA的雙股螺旋結構(左),A、T、C及G的結構式(右)。
▲DNA的雙股螺旋結構(左),A、T、C及G的結構式(右)。
 
當細胞進行分裂繁殖時,會把這套密碼忠實地複製一份,分別藏到子代細胞裡,而可以繼續執行任務。決定核苷酸裡遺傳訊息的密碼,就這樣一代一代地保留下來。

近年來由於基因技術的快速發展,許多分類學家不斷嘗試應用這種新穎技術於物種的分辨上。由聚合酶連鎖反應-隨機放大多型性核苷酸法、直接定序分析比對法,進而到目前最普遍使用的聚合酶連鎖反應-限制片段長度多型性法,分析方式由複雜逐漸趨於簡單化、快速化,也使得基因技術在物種的分類上有更重要的貢獻。同時也創造出另一項應用,即食品原料物種的鑑定。

原先以傳統方法鑑定經加工後的魚肉製品有許多困難,學者就藉由「粒線體核苷酸」的基因密碼分析其序列差異,以了解原料物種的來源,因此建立了一套物種鑑定的新方法。

鑑別物種的目標基因

以粒線體核苷酸鑑定物種
 利用粒線體核苷酸鑑定物種,是因為它的遺傳多型性最早被完整研究,例如目前已澈底了解人類、老鼠和牛的粒線體基因。此外,粒線體核苷酸有以下幾個特點可以用來重建親緣關係。

(1)遍存於真核生物中,幾乎所有物種都具有相同結構。(2)容易分離與操作。(3)基因結構簡單。(4)演化上的變異很單純,主要是鹼基的取代。(5)基因傳遞過程無重組,是直線式的。(6)能提供一組特徵以推斷親緣關係。(7)演化快速,適於親緣相近生物的比較。

一般而言,在動物中粒線體核苷酸具有一些生物共同特徵,這些特徵也是重建親緣關係的重要因素,理由如下。

(1)遺傳特性是單套,且是母系遺傳,不受有性生殖干擾,因此可回溯演化歷史。(2)粒線體核苷酸本身缺乏修補機制,在複製過程中比較容易發生突變,因此演化速度比細胞核內核苷酸快1至10倍。(3)雙股環狀分子,長約16,000~20,000鹼基。(4)無內隱子(intron)、偽基因(pseudogene)等中斷基因。(5)基因序列在門或綱階層內仍很穩定。

以細胞色素b基因鑑定物種 以細胞色素b基因做為鑑別物種的指標,理由如下。
(1)位於粒線體核苷酸中tRNA Thr與tRNA Glu基因片段之間,長約1,200個鹼基對,是粒線體中特有的。最早在粒線體核苷酸中被設計出來的引子就位在這一片段,因此是物種中了解得最透徹的片段基因,研究學者也認為是探索物種演化相關性的開端。
(2)細胞色素b基因有動物間序列極相似的保留區,可供設計引子複製出大部分脊椎動物的基因。
(3)粒線體核苷酸序列因種屬之間的不同而有差異,藉著這方式可以判斷親緣相近的種類。
(4)細胞色素b位於粒線體內膜,含9至10個蛋白質,在粒線體氧化磷酸化反應中構成複合體Ⅲ。複合體Ⅲ發生轉移電子至細胞色素c,同時伴隨發生的是質子通過粒線體內膜,且包含了電子傳遞中重要的氧化還原中心丙二酮分子。

擴增部分基因體辨別物種

聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)是現在分子生物領域中最廣泛使用的基本技術。PCR的理論於1970年代提出,但是當時基因定序技術尚未建立,因此這項構想很快就被遺忘了。15年後,再次被人提出,這次科學家把它實際化,並正式命名它。

PCR是利用少量的核苷酸原料在體外大量增幅,其數量可達2n倍。這項技術對於刑事案件證物的鑑定、生物多樣性、稀有動物的保育,以及物種的分析和鑑定有很大的幫助。因為在刑事現場或生物身上只能採集到微量的核苷酸樣本,如頭髮、體液等,但利用PCR放大就很容易進行下一步的分析、定序等鑑定步驟。

要進行PCR之前,必須知道待增幅區域兩端的序列,以設計一對引子。PCR可分做3個步驟。第一步是變性,以加熱的方式把含有標的片段(也就是想做增幅的區域)的DNA模板雙股核苷酸分開,一般要把雙股核苷酸完全分開須加熱至攝氏95度。

第二步是引子黏合。這階段要降低溫度,使引子能黏合至單股模板核苷酸的互補序列上。由於每一種引子和模板核苷酸黏合所需的溫度不同,而且有許多因素會影響PCR的結果,因此須先測試出一個信號最強、雜訊最少的黏合溫度,一般大約是攝氏五、六十度。

第三步是延展或稱聚合作用。核苷酸聚合酶可從引子3'端進行聚合反應,合成新的雙股核苷酸,一般核苷酸聚合酶的最佳反應溫度(也就是延展溫度)是攝氏72度。

以這3個步驟為一個循環,接下來再重複這3個步驟進行另一個循環,一般一個PCR要執行25至30個循環。這增幅方式是以等比級數增加片段的數量,因此理論上只需要進行25個循環,產生的標的片段核苷酸就可達原來的225倍。

實際案例

衛生署、漁業署長期以來就以各類宣導方式,加強加工業者和民眾對於河魨魚種的辨識能力及正確的使用方式,但誤食、誤用或濫用有毒河魨魚種做為香魚片原料的情形仍時有所聞,也經常造成嚴重中毒的悲劇。
 
經加工後的魚肉製品以傳統方法鑑定有許多困難
▲經加工後的魚肉製品以傳統方法鑑定有許多困難
 
2000年1月,彰化5名民眾食用不明魚種的魚湯後,出現嘴部麻木、四肢麻痺、昏迷、噁吐、呼吸困難等疑似河魨毒中毒的症狀。其中兩人情況較嚴重,經治療1周後才康復,其檢體證實含有河魨毒(或稱河豚毒)。同年次月,另5名民眾食用香魚片後出現疑似中毒症狀,其殘餘檢體也含有河魨毒。2001年4月,高雄一名民眾食用烏魚子後出現疑似河魨毒中毒症狀,經送醫治療約1周後才康復,殘餘烏魚子檢體經檢測含有河魨毒。

上述3件中毒案例,都曾利用粒線體部分細胞色素b基因的序列分析及限制5切位鑑定其魚種。

在2000年1月的案例中,烹煮過的檢體經粗萃核苷酸後,利用設計好的引子組增幅部分細胞色素b基因序列並定序,與衛生局提供疑似遭誤食的草河魨新鮮魚肉比對,顯示烹煮過殘餘的河魨肝檢體與衛生局提供草河魨的部分細胞色素b基因序列完全相同,而與虎河魨(無毒)、瀧紋河魨(含猛毒)及毒鯖河魨(含猛毒)的序列呈現明顯的差異。

另以限制酶(具專一性,可以辨認特定位置)分解中毒案例殘餘檢體與草河魨的增幅DNA,都呈現同樣限制切位,產生兩片段247個鹼基對和129個鹼基對,因此證實彰化民眾誤食的魚種確實是含河魨毒的草河魨。

第2個中毒案例的殘餘香魚片,以同一組引子組增幅殘餘檢體中部分376個鹼基對的細胞色素b基因序列後,顯示中毒殘餘香魚片的序列與毒鯖河魨的完全相同。再經由限制5確認後,證實其原料魚種是毒鯖河魨,具同樣限制切位,而與虎河魨、瀧紋河魨及草河魨有所差異。

第3個中毒案例中的殘餘檢體,經與毒鯖河魨、黑鯖河魨、白鯖河魨、草河魨、虎河魨和瀧紋河魨的部分細胞色素b基因比對,顯示殘餘假烏魚子檢體的序列與毒鯖河魨的完全相同,而與其他5種河魨的序列呈現明顯差異。且經由限制酶確認後,證實假烏魚子的原料實際上是毒鯖河魨。

烏魚子的加工一般都是反覆加鹽日曬,然而反覆地加鹽容易造成檢測時核苷酸萃取的困難。所幸這次中毒檢體假烏魚子加熱處理可能較少,其核苷酸仍有少量完整,且大部分核苷酸片段大於300個鹼基對,因此順利證實它是毒鯖河魨的魚卵。

以基因體辨別有毒魚種,確實可提供非常準確的科學證據。隨著科技的進步,鑑定的方法也會越趨純熟、簡單及快速。只要基礎基因圖譜的數據資料建立完備,未來可能走向更快速的生物晶片分析,這種技術會是下一階段鑑定技術的主流。
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