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綠色螢光蛋白

瑞典皇家科學院把2008年的諾貝爾化學獎,頒給下村脩、馬丁.查爾菲和錢永健3位科學家,表彰他們在綠色螢光蛋白研究上的貢獻。
 
 
 
螢光蛋白

螢光蛋白的應用對於生命科學的影響,猶如早年顯微鏡的發明對於生物學的影響。17 世紀荷蘭科學家李文霍克發明顯微鏡,使得人類可以看到細胞,從而了解細胞扮演的角色。而 20 世紀末,螢光蛋白的發現和應用,使得生命科學研究學者得以由分子層次的觀點,研究細胞的代謝、恆定、反應、生長、繁殖等現象。

細胞的遺傳分子–去氧核醣核酸(DNA)是所有生命現象的起點。DNA 扮演硬碟般的功能,能儲存各種生命現象運作所需要的程式。一個基因相當於一個程式,平時按特定的方式編排、儲存在 DNA 分子內。當有需要時,細胞就會把基因的開關–啟動子(promoter)打開,使基因開始表現,透過轉錄及轉譯作用形成蛋白質。

蛋白質在細胞內扮演十分多樣的角色,有些能形成支架,維持細胞的結構;有些具有酵素功能,能夠催化反應的進行來提供能量,以及合成各種細胞零組件──醣類、脂肪及核酸所需要的材料。有些蛋白質則是信息傳遞因子,能夠維持細胞內的秩序。細胞之所以能夠正常地分化,以及維持正常的分裂速率,都和這些信息傳遞蛋白有關。細胞之所以癌化,能快速移轉,同時無限制地增殖,很多都和這些蛋白質信息傳遞因子的異常有關。

由此可知,蛋白質對於細胞功能的維持十分重要。如果能夠了解細胞內的蛋白質是在什麼情況下開始生產、產量多少、在什麼地方生產、製造後被送到什麼地方,以及壽命多長,就可以了解細胞運作的模式,以及當它失控時,如何能造成癌症、老年癡呆症、糖尿病等疾病,而有助於新藥的開發。

這也是為什麼很多人認為綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的研究成果,值得獲得諾貝爾醫學獎的原因。筆者認為這項研究成果之所以獲頒化學獎,應和 GFP 對整個生物化學的研究領域有重大的影響有關,而非僅局限於醫學領域。

GFP 的發現和應用,讓研究活體蛋白質的工作變得容易許多。過去雖然陸續有一些蛋白質研究方法的推陳出新,然而不是需要很多的樣品,或是需要經過很繁雜的處理,要不然就是會殺死細胞。有了 GFP 這項利器後,科學家只要事先把 GFP 的基因植入欲觀察的細胞內,待 GFP 產生後,再照射藍光或紫外光,就可以直接觀察活細胞,進行以下的研究:

外來基因是否成功植入細胞 植入外來基因的目的,通常是為了研究這基因的功能、彌補細胞基因的缺損,做為治療用途,或是讓宿主細胞能持續量產這個基因的蛋白質,供作商業用途。常見的做法是把 GFP 的基因和外來基因放在同一個表現載體(vector)上,當宿主細胞開始表現外來基因時,也會同時表現 GFP。這時就可透過 GFP 綠色螢光的出現與否,得知外來基因是否成功植入標的細胞內。

特定基因的表現能力和時間 做法是把 GFP 的基因和特定基因的啟動子放在同一個表現載體上之後,植入細胞。由綠色螢光出現的時間和強弱,可做為判斷這基因表現的時間和強度的依據。

蛋白質的位移和交互作用 把研究對象的基因和 GFP 的基因放在同一個表現載體上,送入細胞,讓細胞製造出兩種蛋白質的複合體。這時就像在這個研究對象蛋白質上裝上綠色的光源,只要看哪裡發亮,就知道這個蛋白質移動到什麼位置。如果要研究兩種蛋白質間是否產生交互作用,可把不同顏色的螢光蛋白接在不同的蛋白質上,只要觀察到兩種顏色有重疊的情形,就表示這兩種蛋白質之間可能產生交互作用。

瑞典皇家科學院於去年的 10 月 8 日,把一年一度的諾貝爾化學獎頒給日本籍的下村脩(Osamu Shimomura)、美國籍的馬丁查爾菲(Martin Chalfie)及美籍華裔的錢永健(Roger Y. Tsien)3 位科學家,表彰他們對於綠色螢光蛋白研究方面的貢獻。

螢光蛋白之父

GFP 發現的故事始於二戰結束後的日本。1955 年,歷經二次大戰的輟學,好不容易完成大學學業的下村先生在大學老師的引薦下,進入名古屋大學平田教授(Prof. Yashimasa Hirata)的實驗室,擔任研究助理的工作。

平田教授想要知道海螢(Cypridina)–一種海洋節肢動物為什麼在壓碎後會發光,這個問題在美國已被研究很長一段時間,卻一直找不到解答。平田教授不願意冒險讓學生做這個題目,因為擔心學生會因此畢不了業,因此抱著姑且一試的想法,要剛到任的研究助理下村先生試試。沒想到下村先生僅花了一年半的時間,就把這個難題解決了。

下村先生在海螢體內找到一種發光蛋白酵素(luciferase),能夠使一種稱為 luciferin 的成分氧化,產生發光反應。下村先生因為這項空前絕後的成就,除了破天荒地拿到名古屋大學的博士學位(按:他並非博士生!)外,也因此受到美國普林斯頓大學強生教授(Prof. Frank Johnson)的賞識,延攬他到美國工作,開啟了他在國外的學術生涯。

1961 年起,下村博士和強生教授開始攜手研究維多利亞管水母(Aequorea Victoria)的發光物質。管水母是一種會發光的奇妙生物,受到刺激時,牠的傘狀形體的邊緣會由原本的藍光轉變成耀眼的綠光。當年的整個夏季,他們足足抓了一萬隻水母,收集傘緣部分的組織,把發光的物質搾出後,經繁雜的純化步驟,最後分離出僅僅幾個毫克能發出淡藍光線的蛋白質「水母素」(aequorin)。這項成果很快地發表於 1962 年的學術期刊中。在同一篇文章中,附帶提到他們在分離水母素時得到的一種綠色蛋白質。

這種蛋白質在陽光下呈現淡綠色,在鎢絲燈下是黃色,在藍光或紫外光下,則會發出強烈的綠色螢光。這是 GFP 首度出現在科學刊物上的紀錄。當時下村博士並不知道,這項研究成果會在數十年後,大大改寫整個生命科學的研究史,並為他自己贏得諾貝爾獎桂冠的殊榮。

1970 年代初期,下村博士著手展開 GFP 螢光機制的研究。他發現這個蛋白質內具有有別於其他蛋白質的特殊化學官能基團,能吸收水母素產生的藍光,同時把能量以綠色光線的形式釋出,這也是為何管水母能變色的原因。現在我們知道這個綠色螢光蛋白具有 238 個胺基酸,分子量 26,900,能形成啤酒罐狀的三級結構。在靠近罐狀結構的中央第 65 到 67 號的胺基酸,在經過一連串的化學變化後,能形成特殊的發色團,進而產生螢光反應。

GFP 之所以能一枝獨秀,成為分子生物研究使用最為廣泛的標記蛋白的原因,在於當它在細胞內表現,需要進行後續的觀察時,只需照射藍光或紫外光即可,不需要額外添加任何的化學試劑,操作十分簡便,對於活體細胞的干擾降到最低,實驗的準確性和可信度相對提升許多。其他的發光蛋白,則因其發光需持續供應 luciferin,操作較為不便,同時可能對所觀察的細胞產生干擾,以至於不受生物學家的青睞。

螢光蛋白的應用

在下村博士發現綠色螢光蛋白之後沒多久,就有科學家對綠色螢光蛋白的基因展開研究,普萊捨博士(Dr. Douglas Prasher)就是其中一員。他在 80 年代開始進行 GFP 基因序列的研究,然而在他完成這個蛋白基因的定序後,卻因無法再籌措到足夠的經費,以至於無法延伸下去,殊為可惜。幸虧在因緣際會下,他把自己的研究成果轉移給查爾菲博士,讓這個綠色螢光基因能發揚光大。

在生物細胞內,蛋白質幾乎決定了身體內大多數的生理反應,而每一個蛋白質都是由一組特定的基因控制生成的。也就是說,當身體需要某種蛋白質時,對應的特定基因就會被活化,開始製造蛋白質。因此,查爾菲的想法是:如果把綠色螢光蛋白的基因接在某些想觀察的基因開關上,當那個基因開始表現時,綠色螢光基因也會開始製造綠色螢光蛋白,當我們看到生物體的某處開始發出綠色螢光時,就表示該特定基因正在表現。

查爾菲在拿到這個綠色螢光基因後,首先指導博士生 Ghia Euskirchen 把綠色螢光基因轉殖進大腸桿菌內,結果發現在利用紫外光照射時,這些細菌確實能產生綠色螢光。這個實驗結果告訴查爾菲一些十分正面的訊息。首先這個綠色螢光的基因確實可以在水母以外的生物體內表現,同時它產生的單一蛋白質產物,在不需額外添加任何蛋白或輔酶的條件下,就可單獨產生綠色螢光,有機會成為良好的蛋白質分子標記,用來偵測細胞內各種基因的表現。

當 GFP 確定能在細菌內表現,同時產生螢光後,查爾菲接著就把綠色螢光基因放進他主要的研究材料–秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)體內。秀麗線蟲已成為現今生命科學研究的模式生物,原因在於牠雖僅有 959 個細胞(雌雄同體成蟲有 959 個,雄成蟲有 1,031 個),然而五臟俱全,同時擁有透明的身體,很容易透過普通顯微鏡的觀察,了解內部臟器的發育和變化。

此外,由於秀麗線蟲約有三分之一的基因是高度保留的基因,幾乎普遍存在於各種的動物中,包括人類,因此透過線蟲的研究,可以幫助人們了解一些未知基因的功能。

查爾菲把這個基因接在線蟲的 6 個觸感接受器神經元的啟動子後面,這個研究成果發表於 1994 年 2 月的 Science 期刊,讀者可以在雜誌的封面照片中,看到線蟲的觸感接受神經元發出美麗的綠色螢光。

螢光蛋白調色盤

當愈來愈多的科學家利用綠色螢光蛋白進行研究之後,開始有人提出新的想法:如果螢光蛋白發光的亮度能夠更亮,發光時間能夠更持久,甚至能夠發出各種不同顏色的光,將可以同時觀察一個生物體或細胞內多種相關的生理反應。而 2008 年諾貝爾化學獎的第 3 位得獎人–錢永健博士,就是因開發出不同顏色的螢光蛋白而獲獎。

錢博士首先針對綠色螢光蛋白的發光機制進行研究。由過去的研究,已知發光基團來自於 65 ~ 67 號胺基酸分子的摺疊、環化和脫水。錢博士進一步證實這些分子還需經過最後的氧化反應,才有辦法形成真正能產生螢光反應的發光基團。

接著他利用點突變的技術改變 GFP 的基因,進而產生不同胺基酸組合的 GFP。研究結果證實藉由這種方法,可以使原本綠色的 GFP 轉變為發出青綠色、藍色、黃色等不同顏色的 GFP 類似物,唯一的遺憾是無法藉由這種方法得到紅色的螢光蛋白。紅光較容易穿透動物的組織,能使得對於動物體的研究容易許多。錢博士雖然無法如願地透過 GFP 蛋白的改造得到紅色的螢光蛋白,卻能以其他人的研究成果為跳板,找出解決之道。

俄國藉的 Mikhail Matz 和 Sergei Lukyanov 兩位科學家,在螢光珊瑚身上找到的一種螢光蛋白 DsRED,能夠發出紅色螢光,然而具有複雜的四級結構,必須結合 4 個蛋白質單體才能形成完整的 DsRED 分子,進而產生螢光。錢博士的研究團隊透過基因改造的方式,重新設計 DsRED 蛋白,使這個會發出紅光的蛋白質分子不但更穩定,同時只要有一個蛋白質單體存在的情況下就可產生螢光,因此較容易接在其他的蛋白質上,成為實用的分子標記。

錢博士的研究團隊陸續開發出各種顏色的螢光蛋白分子,提供其他研究團隊使用。哈佛大學的研究者就利用基因轉殖的技術,讓小白鼠的腦神經細胞表現不同顏色的螢光蛋白,使其腦部發出如彩虹般的各式色彩。科學家們把這個五顏六色的腦神經網絡暱稱為「彩虹腦」(the brainbow)。彩虹腦的製作,有助於科學家們藉由顏色的差別,研究個別神經細胞如何編織在一起,進而形成複雜的神經脈絡。

目前 GFP 也已廣泛運用在其他生物科技的領域。舉例來說,科學家們已開發出一種能夠偵測砷化合物的細菌,在有微量砷存在的情況下,這種細菌就能產生綠色的螢光,藉此可大幅提升民生用水的安全。也有科學家成功開發出能感應黃色炸藥的草本植物,可以用來找到地雷埋藏的位置。在臺灣,也曾推出能表現各種螢光蛋白的斑馬魚,在國內水族業喧騰一時,卻因卡在螢光蛋白專利的問題上,無法成功打開國外市場。

GFP 的發光機制已經十分清楚,也已廣泛運用在生命科學的研究中,持續為人類做出貢獻。目前唯一懸而未決的問題是:管水母為什麼要產生綠螢光蛋白?許多海洋的微生物及深海的動物都有產生發光或螢光蛋白的能力,然而為什麼這些生物要耗費能量,產生這些對於生存和適應似乎沒有幫助的物質?這個謎團有待後人加以闡明。

【2008年諾貝爾化學獎簡介】
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