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蛋白質中的夜明珠–綠色螢光蛋白

在夏夜裡,閃亮迷人的螢火蟲;在淺灣中,隨潮汐漂流的發光水母;在深海中,頭前帶著照亮著黑暗海世界的燈籠魚。這些會發光的生物體內究竟隱藏著什麼奧祕呢?
 
 
 
在夏夜裡,閃亮迷人的螢火蟲;在淺灣中,隨潮汐漂流的發光水母;在深海中,頭前帶著照亮著黑暗海世界的燈籠魚。這些各式各樣會發光的生物,造就了自然界多采多姿的有趣模樣,但這些會發光的生物體內究竟隱藏著什麼奧祕呢?

生物體發出的螢光,可藉由螢光素和螢光蛋白產生。經由螢光素酶催化後,螢光素變成一種不穩定的化合物,以螢光的方式釋放出能量,螢火蟲、海螢就是利用這種方式發光。螢光蛋白是一種可直接發出螢光的蛋白質,它吸收外來的能量,像是紫外線,就會發出螢光。本文的主角發光水母,便是藉由這方式發光。

2008 年,諾貝爾化學獎頒給日本化學家下村脩(Osamu Shimomura)、美國科學家馬丁‧查爾菲(Martin Chalfie)和美籍華裔科學家錢永健(Roger Y. Tsien)3人,表彰他們「發現和應用了綠色螢光蛋白質」。

下村脩 1928 年生於京都,是 3 位得獎人中資歷最老的日籍海洋生物學家。他的科學冒險故事開始於 1950 年代,二次世界大戰結束後的日本。1955 年,求學之路因戰爭而中斷,但仍受名古屋大學平田(Yashimasa Hirata)教授聘為研究助理,要找尋一種海螢磨碎殘骸遇水發光的原理。海螢發光的原理與螢火蟲相同,是由螢光素酶催化螢光素,把它變成一種不穩定的分子,然後放出螢光。

他隨後前往美國新澤西州普林斯頓大學法蘭克‧強生(Frank H. Johnson)的實驗室,探討水母發光機制。水母發光的機制與螢火蟲不同,牠具有兩種特殊的蛋白,一是水母素,另一是綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)。首先由水母的螢光素──水母素發出藍光,藍光經由綠色螢光蛋白吸收後,釋出綠色螢光。

1961 年,下村脩在位於北美西岸的福來德港灣的實驗室,開始研究這些出現於實驗室兩側,早晚潮汐成群且一遇到刺激便會發光的維多利亞管水母。水母會發光的器官位於傘狀邊緣,這些是由許多像是小燈泡的顆粒組成的,把這器官切下再用濾紙擠壓,就能獲得水母發光菁華液。下村脩於 1962 年從這些發光菁華液中,分離並且純化出藍色螢光蛋白,稱為水母素。

這個藍色螢光蛋白是在一次偶然的情況下發現的。有一天下村脩正準備離開實驗室,他順手把部分水母發光菁華液倒進水槽裡並關燈,就在關燈的剎那間,回頭一望,看見水槽竟發出閃亮的藍光。這意外的發現,使得下村脩開始研究發光機制。後來才知道發光的原因是因為海水中的鈣離子和水母素結合,再和空氣中的氧氣反應而釋放出藍光。

在 1962 年他們發表的論文中,除了描述水母素的純化分離方法外,也發表另外一個蛋白質的存在,它在陽光下是綠色,在鎢絲燈下呈黃色,在紫外燈下呈強烈綠色。隨後在 1974 年,他們純化出這一個蛋白質,並稱它為綠色蛋白,後人稱為綠色螢光蛋白。

下村脩沒有預料到存在於發光水母中的綠色螢光蛋白,在被他發現的 30 年後,也照亮了其他生物的細胞,並廣泛應用於其他不會發光的生物上。

2008 年諾貝爾化學獎的另外一個得主馬丁‧查爾菲(Martin Chalfie)博士,今年 61 歲,美國人,目前任職於美國哥倫比亞大學,是生物學教授兼系主任。主要的研究方向是利用秀麗線蟲做為模式生物,探討神經細胞的發育和功能。這次獲獎的主要貢獻,是把綠色螢光蛋白當作基因標籤,用來觀察各種基因在細胞內或生物體內表現的情形。他發展出的技術已可使綠色螢光蛋白在特定的細胞或組織,甚至整個生物個體中表現。

在 1989 年 4 月 25 日的一個下午,查爾菲博士參加系上舉辦的一場生物體發光研討會中,首次認識了綠色螢光蛋白,並大為驚豔。一般螢光素酶需要其他受質參與作用才能發出螢光,但綠色螢光蛋白只需經由紫外光激發便可以放出螢光。

這時一個瘋狂的想法出現在查爾菲博士的腦海中,「是否能把綠色螢光蛋白的基因與另一個基因的啟動子連結在一起,做為觀察這基因在細胞內表現的情形。」要實現這個想法,首先需要獲得綠色螢光蛋白的基因,互補去氧核醣核酸(complement DNA, cDNA)序列才行。但那時候綠色螢光蛋白的 cDNA 序列尚未被科學家發現,幾經波折後,終於在 1992 年 10 月,得到了綠色螢光蛋白的  cDNA 序列。1 個月後,他成功地在大腸桿菌中表現出綠色螢光蛋白,在顯微鏡下可以看到發出綠色螢光的大腸桿菌。

祖籍中國浙江杭州的錢永健,今年 56 歲,1952 年生於美國紐約,童年在新澤西州利文斯頓成長。家族中有許多人很有成就,堂叔是著名的「中國飛彈之父」錢學森,父親是波音公司工程師,舅舅是麻省理工學院工程學教授,哥哥錢永佑是著名的神經生物學家,曾任史丹福大學生理系主任,也是中央研究院院士。

錢永健可說出生於「科學家和工程師世家」,或許從兒時起,錢永健就注定要走進科學。他現在是美國科學院院士、醫學院院士,美國加州大學聖地牙哥分校化學及藥理學系教授。錢永健稱自己研究領域是分子工程學,對於自己的職業選擇,他做了這樣的描述:「我注定了繼承家族的血統,從事這樣的工作。」

身體略顯單薄的錢永健,小時候身體不好患有氣喘,也因為這樣,只能常常在家裡不能到處走動。但他沒有因此意志消沉,反而在家裡尋找自己感興趣的東西。他對化學實驗很有興趣,因此在家中的地下室自己做化學實驗,也愛上能產生奇妙色彩的化學,而且很有毅力,一次就做好幾個小時實驗。

錢永健 16 歲時,獲得人生第1個重大獎項:西屋科學天才獎,這個獎是美國頒給高中學生從事科學研究項目的最高獎,當時是研究金屬和硫氰酸鹽結合而獲獎。之後,錢永健領取美國國家優等生獎學金,進入哈佛大學就讀,20 歲畢業,獲得化學物理學士學位。隨即進入英國劍橋大學繼續深造,並於 1977 年獲得生理學博士學位。

2008 年獲得諾貝爾化學獎 3 人中,錢永健的貢獻是綠色螢光蛋白開發和應用歷程中的最後一步。

他在下村和查爾菲研究基礎上,進一步解開綠色螢光蛋白的發光機制。錢永健描繪綠色螢光蛋白中發光團結構是如何透過化學反應而產生,他發現在綠色螢光蛋白第 65、66 及 67 號位置的 3 個胺基酸相互作用生成發光團的結構,並進一步研究顯示這化學反應需要氧氣輔助。他解開綠色螢光蛋白發光團結構是經由自發性生成,不需其他酵素或化合物來幫助。

錢永健在解開綠色螢光蛋白的發光機制和結構後,便開始以基因工程的方法改造綠色螢光蛋白。經由改變它的胺基酸排序,製造出能發出不同顏色的螢光蛋白,包括藍色、黃色、橙色、紫色等,並讓它們發光更久、更強烈。

綠色螢光蛋白帶來的衝擊

在過去使用顯微鏡礙於技術上的不足,無法直接觀察細胞內的真實情況。然而綠色螢光蛋白的發現,使研究人員可以經由顯微鏡,輕鬆確認生物體內各種基因表現的情形,和生物體內各種功能的相關性。

自 1992 至今,已超過兩萬篇和綠色螢光蛋白相關的學術論文發表,不論綠色螢光蛋白的研究或利用綠色螢光蛋白做為研究工具,都如雨後春筍般蓬勃發展。目前最普遍利用的是:把其他蛋白質與綠色螢光蛋白融合而成融合蛋白,可觀察融合蛋白在生物體內的位置,運輸移動,其他生理功能等現象。另外在不同融合蛋白間,藉由螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的原理,來了解兩個融合蛋白的交互作用。

FRET 的原理是利用兩個發出不同顏色的螢光蛋白,分別以能量供給者及能量接受者的角色存在,當兩者靠近到一定距離(10 ~ 100 Å時,做為能量供給者的螢光蛋白,經過激發光激發後,散射出的螢光被能量接受者吸收,而使能量接受者釋放另一種顏色的螢光。

使兩蛋白質分別和兩種不同的螢光蛋白進行融合,若在兩個蛋白質間偵測到 FRET 的訊號,便表示這兩個蛋白質有交互作用或結合的現象發生。它可應用在蛋白質的交互作用,也可以用在偵測酵素動力反應、高能量分子(例如 ATP、GTP)等。

此外,螢光在生物體內顯像,也是綠色螢光蛋白的另一個主要的應用。使綠色螢光蛋白在特定細胞(幹細胞、癌細胞等)或組織中表現,就可以即時觀察生物體中特定細胞或組織的發育、轉移等現象,這方法突破了以往無法在生物活體中即時觀察細胞或組織的困境。更重要的是可利用多種不同顏色的螢光蛋白,標定不同的胞器或組織,在同一時間點觀察細胞發生或胚胎發育的過程。

這些都是綠色螢光蛋白帶來的重大技術突破。

附錄
  1. 綠色螢光蛋白發光機制:水母素在鈣離子(Ca2+)及氧(O2)的結合下,把化學能轉換成光能,而釋放出藍光(波長 470 nm),這藍光經由GFP吸收後放出綠色螢光(波長 508 nm)。
  2. 啟動子:啟動子能夠穩定地與核醣核酸合成6(RNA polymerase)結合,以啟動下游基因的表現。不同的基因具有不同的啟動子,且同一基因在不同的器官組織中,啟動子會有不同的活性,造成基因表現的組織特異性。
  3. 基因標籤:它是用來標定某一個基因,然後觀察這基因在生物體或細胞內表現的情形。做法是把綠色螢光蛋白(GFP)基因接在A基因上後,若A基因表現,便可以偵測到綠色螢光,藉此做為基因表現的標示。
  4. 查爾菲博士把綠色螢光蛋白質表現在秀麗線蟲的觸感接受神經元部位。做法是把綠色螢光蛋白質的cDNA放到一種表現載體上,緊接在一種啟動子後面,這種啟動子在秀麗線蟲的觸感接受神經元部位有很活躍的表現。他的實驗方法是:首先把這表現載體打入秀麗線蟲的生殖腺,讓其自體受精,進而產生帶有這表現載體的受精卵,經過「細胞分裂」及「發育」成為新的個體後,在顯微鏡下可發現GFP成功地表現在秀麗線蟲的觸感接受神經元部位。
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