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水族館科學:魚兒也看病吃藥?

當水族館中的魚兒發生疾病時,為了找出原因,相關人員要如同偵探般抽絲剝繭地尋找線索,並利用各項檢驗技術釐清真兇進而解決問題。
 
 
水族箱一景。(圖 / 種子發)
▲水族箱一景。(圖 / 種子發)
 
魚病診療,完整流程缺一不可
 
踏入水族館後,映入眼簾的是許許多多千奇百怪,具有特色的水中生物。看著牠們悠然自得的模樣,除了讓人感到新奇之外,也帶來不少舒壓感覺。然而在這些生物展示的背後,其實需要付出相當的人力與資源來維持。
 
 
對於如何照護這些生物的健康是門大學問,畢竟這些生物可能遠離牠們的原生環境來到陌生的人工環境中,這當中如環境水質、宿主、病原微生物與飼養管理過程任何一個環節出現問題,都可能對生物健康造成威脅。而具傳染性的病原微生物包含病毒、細菌、真菌、寄生蟲等都是生物安全上須注意的風險,如何及早發現問題與正確診斷疾病成為維護這些水族生物健康安全的重要關鍵。

 

早期魚病診療在專業人才與技術設備較為不足的環境下,靠著口耳相傳的經驗處理現場養殖魚類的問題是十分常見的情形,這也造成盲目用藥和藥不對症所導致的惡果。隨著魚病研究的累積、人才的投入與病原檢測技術的發展,越來越多的工具與技術可以幫助我們進行魚病的診斷,以達到迅速確診、有效用藥的目的。

 

魚病的檢查流程示意圖。
▲魚病的檢查流程示意圖。

 

一般而言,魚病診療過程包含病歷問診、水質檢驗、溼壓片檢查、病理解剖、臟器抹片檢查等。如同偵探辦案一般,有越多線索,破案的機率就越高,而靠現場勘查與相關飼育人員問診建立的完整病歷資料,有助於回推相關的風險因子。

 

水質檢驗有助於了解環境狀況(如溫度、溶氧、氨、亞硝酸、pH值、金屬離子等)是否發生異常而造成影響。溼壓片檢查通常取鰓、體表黏液或鱗片置於載玻片上,加適量的生理食鹽水後覆蓋上蓋玻片,就可在光學顯微鏡下觀察鰓組織的結構是否正常,以及有無病原的存在。病理解剖可對各器官組織直接進行肉眼病變檢視,而某些病原會造成典型的病變特徵,如奴卡氏菌因會造成組織肉芽腫病變,常可見組織器官有密發結節的病徵,因此可作為初步診斷的參考。

 

取病魚鱗片進行溼壓片檢查可見到鐘形蟲(綠色箭頭)。
▲取病魚鱗片進行溼壓片檢查可見到鐘形蟲(綠色箭頭)。

 

此外,剖檢過程中可為後續的相關檢查項目進行微生物或組織採樣。臟器塗抹片檢查是把臟器組織直接塗抹在載玻片上,經染色後在光學顯微鏡下觀察有無病原存在,而作為疾病初步診斷的指標之一。依據上述檢查結果,初步進行診斷並先行給予處置,為的就是能及時控制病情使不致惡化。往後較為詳細耗時的實驗室檢查項目,則有助於釐清與驗證真正的病因。

 

經病理剖檢可見到感染奴卡氏菌症的魚隻脾臟有密發性大小不一的白色結節病徵(綠色箭頭)。
▲經病理剖檢可見到感染奴卡氏菌症的魚隻脾臟有密發性大小不一的白色結節病徵(綠色箭頭)。

 

組織病理學檢查,病原檢查

 

採取新鮮病變組織以10%中性福馬林固定,之後經一連串脫水、石蠟包埋、切片、染色、封片等步驟完成切片。透過這些組織病變的檢查結果,可告訴我們動物受到何種程度的傷害,甚至肉眼無法觀察到的病變也能在組織病理切片下一覽無遺。而除了常用的蘇木素——伊紅染色外,也能根據需求選擇其他的染色方法(如革蘭氏染色、抗酸染色或免疫組織化學染色等)達到病原觀察的目的。

 
鏈球菌感染的魚脾臟組織經臟器塗抹後行經劉氏染色,在光學顯微鏡下可看到多量鏈球菌(紅色箭頭)與吞噬鏈球菌的白血球細胞(黃色箭頭)。
▲鏈球菌感染的魚脾臟組織經臟器塗抹後行經劉氏染色,在光學顯微鏡下可看到多量鏈球菌(紅色箭頭)與吞噬鏈球菌的白血球細胞(黃色箭頭)。
 
鏈球菌感染的魚心臟經組織病理切片檢查,呈現心包膜炎,間皮組織增生並可見細菌團塊(黃色箭頭)在其中。
▲鏈球菌感染的魚心臟經組織病理切片檢查,呈現心包膜炎,間皮組織增生並可見細菌團塊(黃色箭頭)在其中。
 

細菌生化性狀鑑定,初步篩選與參考價值

 

早期分子生物技術尚未普及時,魚類細菌病原的診斷可利用傳統生化學及血清學作為初步依據,由革蘭氏染色性與菌體形態及依靠各類特殊培養基對細菌進行培養與篩選,如弧菌常透過硫代硫酸鹽─檸檬酸鹽─膽鹽─蔗糖培養基。以這種選擇性培養基作為初步篩選,其中膽鹽成分可抑制大多數細菌生長,生長發育的菌落顏色則可反映出細菌本身是否有利用蔗糖的能力(綠色菌落是不利用蔗糖,黃色是利用蔗糖後產酸)。

 
利用硫代硫酸鹽─檸檬酸鹽─膽鹽─蔗糖培養基作為弧菌的初步篩選。
▲利用硫代硫酸鹽─檸檬酸鹽─膽鹽─蔗糖培養基作為弧菌的初步篩選。
 
爾後就有利用這些微生物龐大的生理生化性狀數據建立的菌種資料庫,發展出商品化的鑑定系統如API微生物鑑定套組,應用於某些革蘭氏陰性菌、陽性菌或酵母菌的鑑定。但是由於各水生動物所分離的細菌其生存的自然環境變異較大,水域細菌的分歧度也遠較人體分離菌株高,因此利用商業套裝產品鑑定系統鑑定水產病原菌的正確性,遠低於醫學人體分離菌的鑑定。此外,受限於菌種資料庫缺少某些水生動物細菌種類的資料而有其局限性,但其結果在水生動物病原鑑定上仍有一定的參考價值。

 

分子生物學檢查,病原檢測更快速精準

 

近年來分子生物技術發展快速且應用普及,可彌補其他水生動物疾病診斷方法上的不足,特別是在病原檢測與鑑定上有其優勢。這類方法大致是以病原核酸檢測為目的,透過擴增特定基因片段進行檢視或分析比對,作為病原檢測或鑑定用途。較具代表性的方法是聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR),其原理簡單來說是在試管外利用去氧核醣核酸聚合酶對基因片段進行專一性的鏈鎖反應,進而快速複製放大特定基因片段,廣泛應用於臨床檢測、分生技術、生物科技等。

 

此外,更有許多以PCR為基礎所發展出的分生技術,如單管多引子聚合酶鏈鎖反應、恆溫式圈環形核酸增幅法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反轉錄聚合酶鏈鎖反應、即時聚合酶鏈鎖反應都為病原檢測與疾病診斷提供有效的利器。其中LAMP是在2000年由日本Notomi等人所發展出操作簡易、反應快速的技術,其反應在1小時以內就可完成。

 

由於利用特殊Bst DNA聚合酶的特性,因此可在恆溫下(攝氏60~65度)完成反應,也省去較為昂貴的設備,相較於PCR更適合用來檢測田間樣本,且靈敏度普遍優於PCR。除了可在電泳膠片上檢視呈現梯形連續片段的反應產物外,由於LAMP反應過程會有大量副產物焦磷酸形成,可與鎂離子反應後產生白色的焦磷酸鎂沉澱,因此能依反應產物的濁度進行肉眼判讀,或直接加入螢光染劑如SYBR Green I於產物中,依其螢光呈色以肉眼判斷陰、陽性,省去電泳分析所需的設備與時間。

 

綜觀近來水生動物病原應用LAMP的研究報告,不難發現這技術已逐漸成熟,且廣泛應用於各種病原檢測,甚至已有水生動物病原LAMP相關商品化套組可供臨床檢測。上述技術多是在有「懷疑對象」的情況下會採取的方法,當遇到不知名的菌種或病原時,核酸定序分析不失為另一個解決途徑。透過微生物的核酸序列保守區域(如細菌的16S rDNA)進行擴增及定序,與基因資料庫如美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的基因銀行比對出最符合的微生物種類。

 

相較於養殖魚類背景資料與相關研究的完整性,水族館生物由於物種多樣性及稀有性致使相關疾病或研究資料更顯匱乏。因此對於水族館魚類問題的檢診,除了參考有限的報告或其他養殖魚種資料外,更需仰賴現場飼育管理人員提供的資訊、檢驗人員的專業經驗,以及相關的檢驗診斷方法找出真正的問題所在。而其他診斷工具與技術,如以免疫學為基礎發展的病原免疫檢驗試劑、電子顯微鏡技術或病毒培養等,也可用以作為疾病診斷的輔助。

 

魚病處理,投藥因「魚」制宜

 

當找出問題或病因後,就要針對問題加以處理,如飼養管理或環境的改善、病魚的隔離或營養補充等,而傳染性疾病處理通常需要搭配藥物的使用。養殖食用魚類由於考量到食安問題,因此目前僅有14種抗菌劑與1種殺蟲劑可供合法使用。相較之下,觀賞魚的用藥較有彈性與選擇,因此有較多的「武器」可用來對抗病原。

 

雖是如此,仍應針對診斷的結果選擇正確的藥物,並遵循正確的用藥劑量、投藥方式與時間才能達到有效的治療效果。而抗菌劑感受性試驗——瓊膠紙錠擴散法可用來幫助獸醫師選擇臨床治療有效的藥物,以用於治療細菌性感染疾病。這方法是在培養基塗上定量的細菌後貼上各種抗菌劑紙錠,若這細菌對某種抗菌劑敏感,就不會在這種抗菌劑周圍生長,進而形成空白的抑制圈。而有效抑制圈大小的標準,會依據抗菌劑的種類、濃度與目標細菌有所不同。

 

相較於細菌與寄生蟲性疾病的發生可依賴藥物治療,水生動物病毒性疾病則鮮少有藥物可供使用。因此在飼養管理的操作上,如及時隔離病魚及移除死魚、人員器具與環境池水的消毒、暫時性的禁食,以及投與免疫促進劑增強動物本身的免疫能力,都可以作為病毒感染時的處理。

 

另外,某些病毒性疾病可藉由暫時性改變環境溫度來緩解發病機率與死亡情形。如神經壞死症病毒在高溫下會加快魚體內病毒的複製速度,容易導致魚隻發病,而錦鯉泡疹病毒好發溫度在攝氏18~28度間。有些病例在水溫超過攝氏30度罹病魚隻死亡情形會降低,這對某些病毒性疾病而言,不失為另一種處理的手段。

 

針對寄生蟲疾病,除了使用藥物控制外,對於某些寄生蟲(如異形吸蟲)因其生活史需靠中間宿主(如螺貝類等)完成,移除中間宿主以阻斷其生活史,能間接達到控制疫情傳播的目的。生物防治方式也可應用於某些外寄生蟲的控制,如混養俗稱魚醫生的裂唇魚對於魚隻貝尼登吸蟲(又稱白肌蟲)的侵擾問題有一定程度的幫助。

 

雖然透過上述種種的處置方法對魚類疾病發生可能有所改善,但最理想的目標應該是防範於未然。通過良好的飼養管理、新進魚隻落實的檢疫與穩定合適的水質環境,更能減少魚兒生病的機率,也能讓這些水族館生物向大眾呈現牠們健康活力的一面。

 
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