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核醣核酸干擾–不容忽視的沉默

核醣核酸干擾作用的分子機制,使得細胞裡某些基因發生沉默現象,是基因體學研究極為有用的工具。這個基因沉默作用的發現受到2006年諾貝爾生理或醫學獎的肯定。
 
 
 
西元1869年,印度聖雄甘地藉著「沉默」且非暴力的不合作運動,成就了一個國家的誕生。百多年後的今天,科學家們發現不管是植物或動物的細胞裡,時時刻刻都在進行著一種稱為「基因沉默」的作用,這個作用很可能就是造就地球上生物多樣性的一個重要關鍵。這個基因沉默作用的發現不僅受到2006年諾貝爾獎的肯定,也在科學的發展史上豎立一座新的里程碑。

2006年10月2日,位於瑞典首都斯德哥爾摩的卡洛林研究院諾貝爾委員會,祕書長漢斯.喬瓦教授與戈蘭.漢森教授共同宣布諾貝爾生理或醫學獎,由美國史丹佛大學教授安德魯.費爾(Andrew Z. Fire)和麻薩諸塞大學教授克雷格.梅洛(Craig C. Mello)兩人共同獲得,表彰他們發現核醣核酸干擾(RNA interference, RNAi)—一種由雙股核醣核酸誘發的基因沉默作用。

兩位得獎者

安德魯.費爾(美國籍,1959年生)在1978年取得柏克萊加州大學數學學士學位後,隨即進入麻省理工學院,於1983年取得生物學博士學位,當時費爾年僅23歲。之後,費爾獲得獎學金,到英國劍橋大學分子生物學大師悉尼.布瑞納的實驗室進行博士後研究工作。回美國後,在1986年至2003年間,費爾任職於華盛頓卡內基研究院的胚胎學系,實驗室位於馬里蘭州的巴爾的摩市。

在這段長達18年的研究歲月裡,費爾一直以線蟲(Caenorhabditis elegans)為模型,從事遺傳變異影響細胞和生物體的相關研究。2003年費爾離開卡內基研究院,進入美國加州史丹佛大學擔任遺傳學和病理學教授。2004年獲選為美國科學院院士。目前,費爾還擔任美國國家衛生研究院生物科技中心與科學顧問委員會的委員。

克雷格.梅洛(美國籍,1960年生)小時候經常伴隨從事古生物學研究的父親在美國西部尋找化石,因此對地球歷史、生命起源等問題產生興趣,在耳濡目染與父親的影響下進入了科學界。梅洛於1982年在美國布朗大學取得科學學士學位,1990年取得哈佛大學的細胞與發育生物學博士學位,隨即進入西雅圖的福瑞得哈欽森癌病研究中心,從事博士後研究工作。

1994年,梅洛轉到麻薩諸塞大學醫學院任教,並擁有自己的實驗室,開始以線蟲為模型,研究線蟲在發育過程中胚胎細胞的分化與溝通,以及如何在線蟲發育過程中剔除或抑制特定基因的表現。也就是在這個時候,梅洛開始與費爾合作,並在2005年獲選為美國科學院院士。兩人獲得諾貝爾獎的研究成果是在1998年發表的,從發表到獲得諾貝爾獎的肯定只隔了8年的時間,對諾貝爾獎而言是相當短的紀錄。

生命科學的發展

相信每個人都知道,基因對生物體是非常重要的,因為基因體是整個生命的藍圖。從細胞的角度來看,絕大多數的基因是位在細胞核內的染色體中,只有少部分基因是在粒線體或葉綠體內,而且基因的表現是在細胞質中進行蛋白質的合成。回顧科學的發展史,1944年科學家找到了神祕的遺傳物質—去氧核醣核酸,也就是大家耳熟能詳的DNA,法蘭西斯.克立克(Francis Crick)與詹姆斯.華生(James Watson)並於1953年解出DNA著名的雙股螺旋結構。

知道DNA的結構之後,科學家最想解決的問題是:細胞核內的DNA是如何在細胞質中合成蛋白質的?這個問題在核醣核酸(RNA)發現後衍生出一個假設,認為單股的RNA才是DNA與蛋白質合成之間的遺傳訊息傳遞者。這個假設經歷時間的驗證,成為今天生物遺傳學中屹立不搖的法則。簡單來說,遺傳訊息的傳遞流程就是由DNA轉錄成RNA,再由RNA轉譯成蛋白質。

1961年法蘭索瓦.雅各(Francois Jacob)和雅奎斯.莫諾(Jacques Monod)提出一個假想的基因控制模型,並在1965年與安卓.沃夫(Andre Lwoff)共同獲得諾貝爾生理或醫學獎。在這個模型中,他們提出基因會被轉錄成特定的RNA,並把這種RNA稱為訊息RNA(messenger RNA, mRNA)。

不久之後,馬紹爾.尼倫博戈(Marshall Nirenberg)和格賓.克拉納(Gobind Khorana)成功破解了遺傳密碼,他們發現mRNA序列上是以3個核啟酸為一組密碼,並且定義出每組密碼所對應的胺基酸。這一重大的貢獻,讓他們摘下1968年諾貝爾生理或醫學獎的桂冠。

其實早在多年前,法蘭西斯.克立克就已經預測到mRNA和胺基酸之間,應該存在著另一種較小的RNA分子做為轉接,而這種RNA具有把mRNA密碼對應成胺基酸的傳遞功能,之後這種RNA分子被稱為傳遞者RNA(transfer RNA, tRNA)。

在DNA構造被破解後,分子生物學的研究持續發燒,到了RNA被發現後,又創造了另一個研究熱潮,在這一波接著一波的熱潮中,造就了許多的諾貝爾獎得主,也顛覆了很多學術界的傳統認知。像是1993年的諾貝爾獎就是表揚菲力普.夏普(Phillip Sharp)和李查.羅勃茲(Richard Roberts)發現的mRNA剪接作用(splicing),推翻傳統認為DNA與mRNA序列完全對應的觀念。

還有稍早之前,1989年諾貝爾化學獎得主悉尼.奧特曼(Sidney Altman)和湯瑪士.柴克(Thomas Cech)證明RNA本身還有催化能力,可以自我複製甚至能合成其他RNA。
許多研究結果顯示,RNA也許就是地球上最早出現的遺傳物質。也就是說,在DNA出現之前,就已經有了一個以RNA為主要遺傳物質的世界,在DNA出現之後,RNA就成為DNA與蛋白質之間的訊息傳遞角色。而RNA具催化能力的發現,不只是在生物演化上有重大的影響,同時也暗示著在基因表現的調控上,RNA可能扮演更為活躍的角色。

事實上,除了mRNA之外,科學家已經發現還有很多序列比較短的RNA存在於細胞中,這類的RNA雖然不能轉譯出蛋白質,但是仍有不可磨滅的重要性。本文主角RNAi的機制,就是由這些短小的RNA所引發的基因調控現象。

1980年初期,科學家們就已經在大腸桿菌中發現這類序列較短的RNA,並且知道這類RNA可以跟序列互補的mRNA結合,從而抑制蛋白質的表現,這類的RNA稱為反義股RNA(antisense RNA)。反義股RNA一開始並不受科學家的青睞,直到1993年在線蟲發育研究中,找到同樣的反義股RNA基因調控方式後,這種基因調控方式才受到學者們的注意。

爾後,如雨後春筍般地,陸續在許多物種中都發現到相似的小分子RNA。2001年後,這些原本毫不起眼的小分子RNA伴隨著RNAi聲名大噪,儼然成為分子生物學界的超級明星。雖然被稱作微小RNA(microRNA, miRNA),感覺好像並不起眼,但是卻在整個生物醫學領域引領風騷。因為2006年眾所矚目的第一個諾貝爾獎光環就是套在RNAi上,而RNAi機制的啟動靠的就是miRNA一族中的siRNA。

小兵立大功–線蟲

線蟲在RNAi的發現上扮演著功不可沒的角色,在牠小小透明的軀體裡,一再帶給人們意想不到的驚喜。線蟲的身長約1公釐,通體透明,壽命短,只要用低倍率的顯微鏡就能觀察,相當方便。因此從1960年開始,線蟲就被用來研究器官及細胞成長機制,是標準的生物模型之一。

相對於複雜的哺乳類動物來說,線蟲的生理構造是再簡單不過了。不過麻雀雖小,五臟俱全。線蟲從肌肉細胞到生殖細胞,一應俱全,樣樣不缺。透過深入的研究,可知線蟲在發育過程中會長出1,090個細胞,其中有131個細胞會有計畫性地死亡,因此成熟的線蟲只有959個細胞。最早把線蟲當作研究模型的是悉尼.布瑞納,他與羅伯特.霍維茲(H. Robert Horvitz)及約翰‧薩爾斯頓(John Sulston)標示出計畫性細胞死亡路徑,獲得2002年的諾貝爾獎桂冠。

就基因層面來看,線蟲的細胞有6個染色體,約含1萬8千個基因,這個數目令人驚訝,因為比線蟲複雜的人類,也不過約含3萬2千個基因。更令人嘖嘖稱奇的是,線蟲的基因有三分之一以上都可在人體內找到,這個發現為遠古時期人類與蟲類可能源自於共同祖先的理論提供了一個佐證。

透過對線蟲的了解,除了對人類自身多了一份認知外,研究線蟲在治療疾病方面更有其不可抹煞的貢獻。這次諾貝爾獎表揚的RNAi,就是另一個從線蟲身上挖掘出來的寶藏。反觀,如果是以複雜的哺乳動物為研究模式,也許不是那麼簡單就能發現RNAi了。

RNAi的發現

早在發現RNAi之前,就已經在植物中發現一種奇特的基因沉默的現象。1990年,凱洛琳.拿坡理與亞歷山大.凡得卡羅的兩組研究團隊,都在矮牽牛花的花色基因調控實驗中發現,原本預期以基因工程方式來創造顏色更深、更鮮豔的矮牽牛花,結果卻出乎意料地出現白花,原本是應該大量表現的花色素基因原因不明地沉默了。當時把這種基因活性沉默化的現象稱為共同抑制,可惜當時並未深入探討,留下一絲的遺憾。

這個謎團直到1998年才被破解,安德魯.費爾與克雷格.梅洛和其他同事們,在線蟲的研究中再次驗證了基因沉默現象。當年他們的研究發表在著名的科學期刊《自然》(Nature)上,文章內容主要是把RNA注射入線蟲體內後觀察對基因表現的影響。不同於以往的實驗設計是,他們所使用的RNA是把正義股(sense)和反義股(antisense)相互黏合形成的雙股RNA(double-stranded RNA, dsRNA),而非單獨只有正義股或只有反義股的RNA,也就是這種獨特的實驗設計造就了今天RNAi的發現。

實驗結果發現,只有注入dsRNA時才能有效地把目標基因的表現活性降低,而且注入線蟲細胞內的dsRNA只會抑制含相同RNA序列的特定基因。這樣一個有別於常理的結果,曾在發表時引來不置可否的異樣眼光,直到哺乳類動物中也發現同樣的現象時才獲得認同。

這篇文章中敘述了有條不紊的實驗設計,並呈現了一系列明確的實驗結果。主要的結果可以總結為以下幾點。
  1. dsRNA對基因沉默作用的效果最好,只有正義單股或反義單股的RNA,不是效果較差,就是沒有效果。
  2. 沉默作用具專一性,只會針對與dsRNA有互補序列的mRNA產生作用,對於其他mRNA則不會產生作用。
  3. 所針對的目標mRNA會經由降解作用被分解掉,但這個基因的起動子和插入子並不會被分解掉,由此可以推測調節機制是在細胞質中進行的。
  4. 在每個細胞中,只需要注入少量的dsRNA就能夠達到幾乎完全的沉默作用。這一現象指出,dsRNA的表現量可能會在細胞中被放大,或者dsRNA本身以催化劑的方式進行反應。
  5. dsRNA的效用可以在組織間擴散,甚至傳遞到線蟲的後代中,據此推測,基因沉默效力可以在細胞間傳遞。
因此,他們創造了「核醣核酸干擾」這個術語,並大膽推測dsRNA中的正義單股RNA並沒有抑制基因表現的功能,只有能與mRNA完全互補配對的反義單股RNA才具有沉默基因的功能。此外,安德魯.費爾也預測到RNAi現象可能是一些較低等的生物體用來防禦病毒的策略。爾後在果蠅、阿拉伯芥等生物模型中,也發現具有RNAi調控的基因沉默現象。

然而RNAi現象的研究在哺乳動物細胞中,一度遇到了瓶頸,直到2001年初,湯瑪士.涂許爾發現,只有在以約21個核苷酸長度的dsRNA處理下,細胞才會產生RNAi現象,率先證明哺乳動物細胞也會使用RNAi來抑制特定基因的表現,因此證明RNAi現象普遍存在於真核生物之間。最明顯的例子就是,進行出芽生殖的酵母菌類也有RNAi現象。至此,RNAi的觸角自植物延伸到了哺乳類動物。

RNAi的作用機制

在發現RNAi現象後,經由科學家們鍥而不捨的努力,它的生化機制慢慢被揭露,證實約21至23個核啟酸長的dsRNA是引發RNAi現象的關鍵。實驗結果顯示,RNAi所控制的基因沉默過程中,一開始是長鏈的dsRNA會經由切丁瓷進行切割。顧名思義,切丁瓷的作用就是把dsRNA像切雞丁一樣,切成一小段一小段的,每小段約21至23個核啟酸長,切好的片段稱為小片段干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)。

接著siRNA會與細胞質內的核醣核酸誘導沉默複合體(RNA induced silencing complex, 簡稱RISC)迅速結合,造成siRNA的雙股解開,形成正義與反義兩個單股RNA。其中正義單股RNA會被分解,而保留下來的反義單股RNA會引導RISC結合至與其互補的mRNA上,然後RISC會切斷mRNA。最後,受損的mRNA很快地被分解掉,以至於無法轉譯出蛋白質。如此一來,造成了特定基因的沉默與喪失功能。這一連串流程就是神祕面紗底下的RNAi分子作用機制。

然而,早期以哺乳動物的細胞為模型研究RNAi機制時,曾面臨到相當大的困難,因為比照線蟲的實驗,科學家把dsRNA送入細胞後,並沒有產生預期的基因沉默現象,反倒引起劇烈的細胞死亡。這個現象目前已經得到解釋,即當哺乳動物的細胞中出現大於30個核啟酸長的dsRNA時,細胞會啟動干擾素反應,攻擊所有的mRNA並導致蛋白質的合成終止,使細胞呈現死亡。不過,給予細胞類似經切丁瓷處理過的siRNA,就能成功引導出RNAi的效果。

RNAi的重要性

RNAi的重要性可以總結如下。

RNAi能夠有效防止病毒的感染︰科學家發現,當病毒感染人體的細胞時,細胞可以對病毒所產生的dsRNA進行作用,產生siRNA,而使相對應的mRNA瓦解,因此RNAi可防禦病毒的攻擊以保護細胞。

RNAi可以藉著沉默跳躍基因來維持基因體的穩定性︰如果把基因體比喻為高速公路,而跳躍基因是一群不守秩序的機車騎士,在高速公路上竄來竄去, RNAi就如同交通警察在維持秩序,避免機車騎士造成交通大亂。換句話說,RNAi機制中的成員如果喪失功能時,跳躍基因就容易活動起來造成基因體的改變。如果沒有RNAi,在跳躍基因的作祟下,基因體肯定一點也不穩定。

RNAi的基因沉默作用可看成細胞內基因體的「免疫反應」。伴隨物種長期演化的累積,將近50%的基因體是由外來病毒基因或跳躍基因所組成的。藉著RNAi機制的作用,可以幫助細胞抵禦外來病毒的感染並維持本身基因體的穩定。

與RNAi類似的機制可以抑制蛋白質合成及調控生物體的發育:在發現siRNA所引發的RNAi之後,陸續在植物、線蟲、果蠅、老鼠和人身上也發現到許多大小類似的內生性小分子RNA,稱為miRNA。最特別的是,這些miRNA具有高度演化保留性,存在於不同的生物體中,有著類似的結構及功能。而具有高度演化保留的分子,往往在生物體中扮演重要的角色,miRNA就是其中的一種。

miRNA和siRNA最大的差異在於,miRNA是從髮夾型RNA中利用切丁瓷修剪出來的,而髮夾型RNA主要是由細胞核內的基因表現出來的。siRNA和miRNA相同的地方是兩者都可降解mRNA或抑制蛋白質轉譯,因此miRNA在調控基因表達上也扮演重要的角色。截至目前為止,在哺乳動物細胞裡發現的miRNA約有500種,估計這些miRNA可以調節細胞內大約30%的基因,而基因調控又是生物體成長發育過程中最重要的一環,其重要性不言可喻。

RNAi類似機制能保持染色質的緊實以抑制轉錄作用發生:很早以前,科學家就觀察到植物細胞中存在著一種轉錄作用之後的基因沉默現象,可是卻無法給予解釋。在RNAi發現之後,證明植物細胞是藉由類似RNAi的機制來調節基因活性。另一方面,在酵母菌、果蠅以及脊椎動物等細胞分裂過程中,也都可以發現到類似的RNAi機制用於維持染色質的緊密,同時抑制不必要的轉錄作用發生。

目前對於這種現象的分子機制仍然不是很了解,但是可以確定的是, RNAi類似機制對於維持細胞分裂後的基因體完整性有很重要的貢獻。

RNAi 是檢視基因功能性的新工具:工欲善其事,必先利其器,利用RNAi高效率且專一性的沉默作用,可以隨心所欲地抑制特定基因的作用,也可以用來研究所有基因的功能,而且在速度上也很快。繼線蟲之後,這個技術已應用在各種生命體上。RNAi技術對於基因功能研究的貢獻,不僅用在組織培養的細胞上,甚至在生物體中都可有效應用。

RNAi在未來可做為基因治療的方法:自從可以利用基因轉殖方式以RNAi達到控制生物體內的基因表現後,科學家試著把RNAi運用到醫學治療上。目前已經在動物模式中得到很好的結果,甚至在初步的臨床試驗中也傳出了好消息,但實際運用在臨床治療上,還有一段路要走,且讓我們拭目以待。

對基因體研究的貢獻

研究或探討基因功能的方法之一,是把細胞或生物體內的某個基因剔除,或者抑制該基因表現,然後觀察所產生的影響與改變,進而推測該基因所執行的生物功能。另一種方式是從異常症狀的疾病下手,找出造成疾病的問題基因,依此探究該基因所具備的功能。以上的做法都相當耗費時間、金錢與人力。

針對個別基因進行抑制或破壞,再觀察對生物體的影響,進而推敲出基因在生物作用上所參與的功能,這樣的研究模式稱為逆向功能性基因體學。憑藉高效率且高專一的機制,RNAi技術可以幫助科學家們從事更迅速且有效率的逆向功能性基因體學研究。尤其在人類基因體已解碼的今日,RNAi更是生物或醫學相關研究人員逐一確認各基因功能的重要工具。藉由整合科學家的研究成果,可以建立有效的RNAi序列資料庫以便利各項相關研究的進行。

除此之外,最近科學家發現RNAi不只是沉默基因的表現,若siRNA作用於基因啟動子上反而具有促進基因表現的功能,這項發現大大地提升了RNAi在基因體研究中的彈性與應用性。目前,RNAi技術的應用已經相當廣泛,不僅是逆向功能性基因體學研究的主要方法,也是一種非常具潛力的基因療法。

在醫學與農業上的運用

在臨床與基礎醫學運用上,RNAi技術已廣泛應用在生物或醫學相關的研究中。由於許多疾病是基因表現異常所導致的,科學家希望藉由RNAi技術,抑制過度活化或突變異常的特定基因,開發出對抗病毒感染、腫瘤形成、神經性病變、心血管疾病、荷爾蒙失調等各種疾病的新療法。目前,利用RNAi技術所進行的人類疾病相關研究中,以治療老年性黃斑部病變和呼吸道融合瘤病毒的進度最快。

老年性黃斑部病變與血管內皮生長因子的作用有關,第二期人體臨床試驗的初步結果證實,由siRNA所誘導的血管內皮生長因子沉默作用具有劑量依隨效應,也就是對血管內皮生長因子的抑制效果會隨著siRNA劑量的提升而增加。此外,抑制血管內皮生長因子接受器表現的siRNA也是試驗的項目之一,現在已經完成第一期的臨床試驗,並且有很好的效果。

關於呼吸道融合瘤病毒感染方面,目前已經完成第一期的臨床試驗,參與試驗人數超過百人,是最大宗的RNAi治療試驗之一,而且結果非常令人滿意。其他如神經退化疾病阿茲海默氏症、杭廷頓舞蹈症及第二型糖尿病,則還在動物實驗階段。至於病毒部分,也有多項透過RNAi技術抑制病毒感染的研究在進行中,分別有愛滋病毒、肝炎病毒、人類皰疹病毒等。種種的臨床試驗結果顯示siRNA具有非常好的效用,相信不久的將來就會有RNAi相關藥物問世。

農業專家也對RNAi技術在動植物病害防治、品種改良等方面的突破,寄予厚望。風味香醇的咖啡是很多人無法拒絕的最愛,但是咖啡因所造成的心悸、血壓上升、失眠等問題卻帶來困擾。目前已經有日本科學家應用RNAi技術抑制咖啡因的表現,成功培育出低咖啡因的咖啡樹。依此推演,可以預見未來會有低尼古丁的「安全香菸」出現在世人面前。

可能面臨的問題

RNAi的價值確實值得寄予厚望,但是它與其他基因科技一樣有必須面對的問題。大致上可以把RNAi的啟動分成兩類,一類是採用化學合成的siRNA,直接送進細胞內誘發RNAi的作用。另一類是以DNA載體方式在細胞內表現siRNA。但是由於RNAi作用必須在細胞質中進行,如何把化學合成的siRNA或DNA載體送入特定人體組織細胞中,是目前臨床應用上面臨的重要課題。

再者,雖然可以利用病毒感染幫忙送入特定的目標細胞中,但這個方法具有一定的危險性。而化學合成的siRNA是屬於RNA的一種,因此它的穩定性問題也需審慎應對。另外,siRNA雖然具有高度序列專一性,但仍然有可能發生細胞中所有蛋白質合成被抑制的副作用,導致細胞死亡。RNAi的機制需要藉由RISC去分解mRNA來進行的,因此RISC的突變或是活性飽和度都是需要考量的問題。還有一點,siRNA在哺乳細胞中抑制基因的效果有持續性不足的缺點,維持不了多久就會失去作用。

幸好,RNAi的相關研究進步快速,隨著逐漸了解RNAi作用的分子機制,相信很快會有突破性的進展。例如已經有實驗證明,在siRNA分子的醣基或骨架上進行化學修飾,可以克服持續性不足的缺點,而使siRNA與磷脂質結合,則可以幫助遞送siRNA進入細胞內。

仰望著諾貝爾獎光環照耀下的RNAi時,不禁讓我們低頭細想,其實早在安德魯.費爾和克雷格.梅洛發現RNAi以前,它就已經默默地存在於細胞中,只是我們不知道罷了。那麼回頭看看,地球上的生命在歷經數十億年的演化,肯定還有很多寶藏靜靜「躺在」我們的細胞裡,而這也是科學家們所不容忽視的沉默。

【2006年諾貝爾生理或醫學獎特別報導】
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