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農桿菌–自然界的基因改造者

農桿菌原本是一株令人頭痛的植物病原菌,但因科學家持續不斷地研究改進,而化身為興起今日農業生技產業,產生基因改良作物的幕後推手。
 
 
 
農桿菌演進史

農桿菌從原來只是植病學家研究的對象,演變為農業生物技術的重要技術媒介,其歷史可追溯到西元1897年,義大利的Fridiano Cacara博士首先在葡萄藤的莖部及根莖交接處,觀察到如腫瘤般脹大的病徵。經進一步分離研究,發現它是由桿狀的細菌Agrobacterium vitis感染所致。

1907年,美國農業部的兩位植病學家Erwin F. Smith和Charles O. Townsend也從菊科的瑪格莉特中,分離出這種使植物產生腫瘤的細菌,今稱為「農桿菌」,並在《科學》雜誌中發表這重要發現,開啟了農桿菌的研究。

1974年,美國洛克菲勒大學的Armin C. Braun博士證實植物的腫瘤組織即使沒有細菌存在,仍可繼續增生繁殖,顯示這些受感染的植物細胞已被細菌分泌出的某種物質改變。而隨著近代分子生物學的進步,對於DNA及RNA的了解逐漸增加,終於由比利時的Marc Van Montagu博士和Jeff Schell博士的團隊,在農桿菌中分離出與細菌的腫瘤產生能力有關的大型質體,命名為「腫瘤誘導質體」。

1977年,美國華盛頓大學的Eugene W. Nester博士、Mary-Dell Chilton博士等人更發現,在植物腫瘤細胞中有一段腫瘤誘導質體上的DNA存在,使得受感染的植物細胞產生如此劇烈變化,因此稱這段DNA為「轉移DNA」。這結果顯示農桿菌可以跨越原核生物與真核生物的鴻溝,把遺傳物質從原核生物轉移至真核生物,進而改變真核生物的生長與發育。這些早期的研究結果奠定了農桿菌在植病界的特殊地位。

從此,各研究團隊競相開發腫瘤誘導質體,希望能夠把不同的DNA片段送入植物細胞中。直到1983年,Patricia C. Zambryski博士等人首次建構了農桿菌的載體系統,可成功地把一段外來的抗生素生合成基因送入植物細胞中表現,但不會使受感染後的植物產生腫瘤。這套農桿菌的載體系統成為現今用於產生不同的轉殖植物或基因改良作物的載體系統的基礎。時至今日,已改造出約10種的農桿菌可搭配數十種不同的載體系統,並成功地獲得超過100種以上的轉殖植物。

轉移DNA至植物的歷程

農桿菌感染植物後使其產生腫瘤,是為了能利用腫瘤細胞不斷增生的能力,同時讓腫瘤細胞產生可供農桿菌利用的能量,而不需用到農桿菌本身的資源。這一過程如同跨國企業在國外設立工廠,可以利用較低的成本生產產品,無需慮及會消耗國內的資源。

農桿菌原存在於土壤裡,當植物因機械性傷害或昆蟲咬傷產生傷口時,這些傷口會分泌一些酚類化合物或醣類分子,用於修補傷口或抵抗病原菌入侵。這時農桿菌會利用至少兩種致病蛋白質所組成的感應系統,去感受這些植物分子的存在,進而伺機攻擊植物,開始其感染過程。

這套感應系統如同無線電視接收系統,有一個負責接收訊號的天線,是由VirA致病蛋白質組成,訊號輸出端則是由VirG致病蛋白質組成。VirA蛋白質感受到酚類化合物後,會使VirG蛋白質磷酸化進而活化並輸出訊號。VirG致病蛋白質是一種轉錄因子,可以結合農桿菌中許多種致病基因的啟動子區域,讓許多致病蛋白質經由轉錄、轉譯過程表現在植物感染的過程中。這些致病蛋白質的功能有如跨國企業的國內員工,為建立海外工廠執行了許多重要工作。

農桿菌利用致病蛋白質VirD1和VirD2把腫瘤誘導質體打開,截切一段特定DNA產生單股的T-DNA,將來會被運送至植物細胞中。因為T-DNA的前後端各有一段約25個核苷酸的特定序列,所以VirD2蛋白質可以精確地截切產生T-DNA。

T-DNA產生後,這段T-DNA的前端還會與致病蛋白質VirD2結合,並由VirD2蛋白質引領T-DNA連同其他的致病蛋白質,經由農桿菌的分泌系統分泌出細菌體外而進入植物細胞中。這一過程的VirD2蛋白質就像企業中生產部的主管,會先把需運送至海外工廠的重要機器(即T-DNA)打包,這機器前後都貼有電子條碼(即25個核苷酸序列),以確保打包運送過程不會有遺漏。這主管與助手VirD1蛋白質一起把機器打包後,再由主管親自監督運送至海關,準備裝箱上船運送至海外。

農桿菌利用第四型分泌系統,把VirD2蛋白質、T-DNA和其他致病蛋白質,如VirE2、VirF等蛋白質,從細菌體內送到植物細胞中。第四型分泌系統由VirB1至VirB11和VirD4共12種蛋白質組成,這些蛋白質會形成一穿越細菌內外膜的孔洞及一線狀構造。其中VirD4蛋白質可與上述的VirE2等蛋白質及T-DNA結合,以確保分泌出菌體外的蛋白質是正確的。

VirB4和VirB11蛋白質則可利用消耗腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)所提供的能量,分泌蛋白質及T-DNA。此外,數個VirB7、VirB9、VirB10蛋白質可在細菌的內外膜上結合形成大型的蛋白質複合體。這複合體在農桿菌的細胞膜形成一孔洞,可讓蛋白質及T-DNA通過農桿菌細胞膜。最後在農桿菌體外由VirB2、VirB5、VirB7蛋白質共同組成的線狀構造,可幫助細菌接觸植物細胞,把致病蛋白質及T-DNA送入植物細胞中。

這套分泌系統類似貨物出國前在海關的X光檢查系統,VirD4蛋白質有如海關檢查人員,確認貨物(即T-DNA和致病蛋白質)安全且正確標示。VirB4和VirB11蛋白質則如運輸帶的馬達,確保貨物可進入X光機中,VirB7、VirB9、VirB10則組成X光機讓貨物進入檢查。最後細菌的線狀構造如同細長的輸送帶,把貨物運至正確的港口裝箱上船並運送出國。

當T-DNA及致病蛋白質送入植物細胞後,VirD2蛋白質繼續帶領著T-DNA,VirE2蛋白質則可包覆在單股的T-DNA外提供保護。其中VirD2和VirE2蛋白質還可與植物蛋白質結合,藉由植物細胞中的細胞骨架和其他運輸蛋白質,把T-DNA運送至植物細胞核中。

在這運送過程中,VirD2蛋白質這位生產部的主管非常負責,一路隨著貨物搭船抵達目的地。到達海外後,藉由當地人員(即植物蛋白質)的幫忙,把貨物放上火車,利用內陸的運輸系統—植物的細胞骨架,依主管的指示把海外工廠生產所需的機器(T-DNA)運送至工廠的預定地(細胞核)。

在農桿菌感染植物的同時,後者也會啟動一些防禦機制,以保護植物細胞不受感染,但最終會因農桿菌的致病蛋白質的作用而受到抑制。植物的防禦系統就像任何工廠要建造時,可能會受當地居民或環保團體的反對。但最終經由多次討論和協調,企業與當地居民可以各讓一步達成共識,讓工廠順利興建,猶如T-DNA和蛋白質複合體可進入植物細胞核。

進入植物細胞核後,包覆在T-DNA外的致病蛋白質可與不同的植物蛋白質結合,如與包覆DNA形成染色體的組織蛋白質結合,以幫助T-DNA插入植物染色體中。T-DNA嵌入植物染色體前,還需把包覆在T-DNA外的VirE2蛋白質和其他植物蛋白質,經由蛋白質的泛素—蛋白酶體系統—的分解,使T-DNA裸露,以便鑲嵌入植物染色體中。

在野生種農桿菌T-DNA上,含有負責生合成植物荷爾蒙的基因。當植物細胞表現T-DNA時,會使得植物細胞大量合成植物生長素和細胞分裂素,造成植物細胞不正常地增生分裂產生腫瘤,形成冠纓腫瘤疾病。T-DNA上還有其他負責合成冠纓鹼的基因,因此腫瘤細胞還會產生不同種類的冠纓鹼,如章魚鹼、胭脂鹼、農桿素鹼等。冠纓鹼是一種胺基酸衍生物,可做為農桿菌專一使用的碳、氮來源。

農桿菌感染植物表現T-DNA的過程,猶如建立一座海外工廠,聘請當地的員工(即植物蛋白質),利用當地的資源搭配從海外運來的機器(即T-DNA),生產國內(農桿菌)所需的產品(冠纓鹼)。農桿菌雖只是低等的原核生物,但其感染高等植物的機制,卻如同大型的跨國企業運作一般,既符合經濟效益又極具效率。

農桿菌應用的優缺點

農桿菌能成功有效地感染植物,有二項關鍵因素,即位在Ti質體上的T-DNA和致病基因的表現。約在1980年代,Mary-Dell Chilton博士等人及其他研究團隊發現,只需保留農桿菌中T-DNA前後兩端各25個核苷酸的特定序列,稱為「邊緣序列」,就可以把原本T-DNA內所含有的基因片段置換成其他基因片段,放入植物細胞中表現。

科學家也發現如果把致病基因保留在原來農桿菌的腫瘤誘導質體上,而T-DNA可從原來農桿菌的腫瘤誘導質體上移除,放入農桿菌中其他的質體上,這類農桿菌仍然可以感染植物。

由此科學家了解T-DNA與致病基因可在農桿菌中兩種不同的質體上運作,進而把這特性開發成為現今生物科技中常使用的雙載體系統。上述的兩項重要發現也使得科學家可以改造農桿菌,使它成為把外來基因片段放入植物細胞中表現的載體系統。

使用農桿菌轉殖植物,再搭配植物組織培養的技術,已成為現今常用的生產轉殖植物與基因改良作物的主要方法。這套轉殖系統可適用於許多不同種類的植物組織,如植物的癒傷組織、葉片、花、種子等。相較於其他使用基因槍、電穿孔、微注射或化學藥劑的轉殖系統,這系統的優點是操作技術簡單且成本低廉,轉殖效率穩定並容易獲得轉殖株。利用農桿菌轉殖系統放入的外來基因片段完整,且DNA片段大小較不受限,表現量也較穩定,不易產生基因靜默情形。

目前利用農桿菌轉殖系統獲得的轉殖植物種類已超過140種,包含藻類、真菌、被子植物中的雙子葉植物,少數的單子葉植物及裸子植物。全球現約有10%的農地種植基因改良作物,基改作物中以大豆種植面積最大,其次是棉花、玉米和油菜,占全球基改作物總種植面積的90%以上。

植物生物技術產業及育種學家利用農桿菌轉殖技術,改造提升或增加農作物的性狀,如:提高作物的抗病性、抗蟲性,延緩植物老化,延長花朵壽命,改變植物花色、花香、花形,增加作物的產量,增加作物對高溫、高鹽、缺水的耐受性,提升作物含有的營養成分,增加抵抗除草劑的特性。

在自然界中,農桿菌可感染約600種以上的植物,多數是雙子葉植物。而世界上許多糧食作物屬於單子葉植物,包括水稻、玉米、小麥、大麥、高粱等。但因單子葉植物傷口處或根圈所分泌的化學物質,會使經VirA和VirG蛋白質所誘導表現的致病基因表現量不高或受到抑制,導致利用農桿菌轉殖單子葉植物的系統無法有效地建立。

科學家就改用已知的化學誘導物處理農桿菌,以提升致病基因的表現量,和選擇再生能力較強的植物組織做為材料,終於在1990年代,獲得玉米及水稻的轉殖株。之後,更陸續獲得大麥、小麥、高粱、甘蔗等作物的轉殖株。現今農桿菌轉殖系統已廣泛應用在各種穀類作物,和高爾夫球場的草坪植物。

農桿菌被深入地研究,以及積極地開發與利用,是一個從基礎研究轉而應用於生技產業的最好例子。也因為對於農桿菌的研究,伴隨著實際的生技產業應用的可能性,使得政府單位與許多生技產業有意願資助農桿菌的研究,更使其研究蓬勃發展。但伴隨著科學新知的發現,也使得一些重要的農桿菌轉殖系統的關鍵技術專利化。

把這些關鍵技術專利,固然可保護科學家辛苦研究的成果,但會使得許多由學校單位或非營利機構所開發獲得的基改作物上市的困難度增加,如黃金米就是一個例子,這也不是人類之福。期許不久的將來,學術研究與產業利用能更完美地結合,源源不斷地孕育出可改善人類生活的產品。

深度閱讀
  1. Nester, E., Gordon, M.P. and A. Kerr (2005) Agrobacterium tumefaciens: From Plant Pathology to Biotechnology, The American Phytopathological Society Press, St. Paul, MN. 
  2. Tzfira, T. and V. Citovsky (2008) Agrobacterium: From Biology to Biotechnology, Springer Science and Business Media, New York, NY.
  3. Wang, K. (2006) Agrobacterium Protocols, Humana Press, Totowa, NJ.
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