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光線喚醒的記憶

學習之後為什麼有記憶?有人認為記憶的烙痕存在於大腦的神經細胞之間,若是如此,做為記憶烙痕的神經細胞必須具備的充分且必要條件是什麼? 基因工程學和光學所組成的「光遺傳學法」提供了一個答案。
 
 
「一朝被蛇咬,十年怕草繩」,這是大家熟悉的恐懼記憶。然而,記憶如何形成?記憶的烙痕又是什麼?這是一百多年來神經科學家一直在尋找的答案。有人認為記憶的烙痕存在於神經細胞之間,也就是說,記憶的烙痕存在於一群特定的神經細胞中。

記憶若是刻痕於一群特定的神經細胞,其充分且必要的條件是什麼?過去曾有人把特定的神經細胞去除時,發現可以抹除恐懼記憶。也就是說,沒有了恐懼學習的神經細胞,就沒有了恐懼記憶。這樣的證據提供了恐懼記憶的必要條件,但是充分條件的證據仍然不足。意思是,若一群特定的神經細胞是恐懼記憶的烙痕,那麼必須有一個模擬的實驗,當活化那群恐懼學習時的烙痕細胞,就能出現恐懼記憶。

然而,在多達幾千億的大腦神經細胞中,如何找到特定事件學習時所活化的那群稀少的神經細胞,並且把它喚醒呢?發表在2012年3月《自然》期刊的一篇文章,應用光遺傳學法(optogenetics)標定小鼠在恐懼學習時相對應的神經細胞,稍後再用特定波長的光線來活化這些神經細胞,小鼠就表現了害怕、不敢動的記憶行為。這種方法不僅為大腦的研究提供了新的利器,也回答了神經科學界長久以來的問題。

光遺傳學法是2010年全世界科學家票選出來的年度風雲研究法,這方法結合了基因工程學和光學,可用來觀察和控制一組被基因標定的細胞。基因工程學的部分用來標定細胞,光學的部分則用來活化被標定的細胞。

用來標定細胞的基因有好幾種,其中之一是視紫質通道基因。當神經細胞被這基因標定時,其細胞膜上會表現視紫質通道蛋白。光學的部分是以特定波長活化視紫質通道蛋白,當這蛋白活化時,通道打開,造成神經細胞的去極化,而讓神經細胞活化。科學家就以光遺傳學法來標定恐懼學習的相關細胞,並且利用光纖使它活化,然後觀察恐懼記憶的行為。

利用光遺傳學法來標定和恐懼學習相關的神經細胞,要從哪個腦區著手呢?科學家首先想到的是腦中和記憶息息相關的海馬迴。海馬迴位在腦的邊緣葉,又可細分為好幾個小區,其中之一稱為齒狀回。許多研究顯示齒狀回跟我們的方位感有關,當我們進入一個房間時,有小部分(2~4%)的神經細胞會活化,進入另一個房間時,又有另一小部分的神經細胞會活化。而且這些細胞很忠實,當回到同一個房間時,又是相同的神經細胞會活化。因此齒狀回是一個研究情境記憶烙痕很理想的腦區。
 
海馬迴的腦區之一齒狀回,是研究情境記憶烙痕的理想腦區。當我們處在不同的情境時,會活化不同的齒狀回神經細胞。
▲海馬迴的腦區之一齒狀回,是研究情境記憶烙痕的理想腦區。當我們處在不同的情境時,會活化不同的齒狀回神經細胞。

如何找到齒狀回中記憶烙痕正在形成的那群細胞呢?首先科學家先讓轉殖基因小鼠全身(包括齒狀回)都帶有一個特別基因,這個基因有兩部分,前面是c-fos啟動子,後面是四環黴素調控蛋白(tetracyclin transactivator, 簡稱tTA)的基因。當小鼠學習時,神經細胞活性增加,c-fos啟動子於是啟動tTA基因,而做出tTA蛋白。

另外,利用立體定位儀把特殊重組病毒注射到腦中的齒狀回。這種特殊病毒被設計成帶有視紫質通道蛋白,且這蛋白的表現受到tTA蛋白的調控。當小鼠學習時,c-fos啟動子讓tTA調控蛋白表達出來後,進一步讓視紫質通道蛋白做出來。也就是說,學習時才活化的神經細胞會與眾不同,其細胞膜上由於能表現出紫質通道蛋白而被標定。

如何再度喚醒這群在學習時被視紫質通道蛋白標定的神經細胞呢?做法就是在小鼠的齒狀回埋入光纖,光纖所給予的特定光波可以活化視紫質通道蛋白。視紫質通道蛋白活化後,通道打開,造成神經細胞去極化,而讓神經細胞活化。因此測試記憶時,光纖啟動,神經細胞可再度活化;光纖關閉,神經細胞就不被活化。如此藉由光纖的開關,可在瞬間控制神經細胞的活性,然後觀察小鼠的記憶行為。
 
標定及喚醒記憶烙痕細胞。
▲標定及喚醒記憶烙痕細胞。


要在學習的恰當時機標定特定的神經細胞,還要再多加一個條件,就是在小鼠的食物中給予四環黴素。四環黴素會干擾tTA,使它無法發揮功能。小鼠吃了含有四環黴素的食物,齒狀回神經細胞膜上的視紫質通道蛋白不會表達出來,細胞就不會被標定。相反地,食物中不再給予四環黴素時,tTA就會讓神經細胞膜上的視紫質通道蛋白表達出來,細胞就被標定起來。因此,只要在食物中加入四環黴素與否,就可以控制是否只在學習進行時才把對應的神經細胞標定起來。

要用什麼行為模式來做學習和記憶的測試呢?近二十年來,神經科學界最常用的行為模式稱為恐懼制約學習。這種行為模式的其中一種做法,稱為情境式恐懼制約學習。這個方法在第一天把小鼠放在一個行為箱A中,給予電擊的恐懼制約,第二天讓小鼠回到行為箱A,小鼠就呈現害怕不敢動的恐懼記憶行為。可是如果放在完全不同的行為箱B中,小鼠不會呈現恐懼記憶行為。許多實驗證實海馬迴在情境式恐懼制約學習中扮演舉足輕重的角色,採用這行為模式再適合不過了。
 
情境式恐懼制約。小鼠在行為箱A中接受恐懼制約學到害怕,若把小鼠放回行為箱A,則出現害怕不敢動的恐懼記憶行為。
▲情境式恐懼制約。小鼠在行為箱A中接受恐懼制約學到害怕,若把小鼠放回行為箱A,則出現害怕不敢動的恐懼記憶行為。


然而,要利用光遺傳學法和情境式恐懼制約來提供恐懼記憶的充分條件,科學家們在方法上必須做些修飾。做法是先讓小鼠在行為箱A中待5天,給予四環黴素食物,但是不給恐懼制約。在這種情形下,視紫質通道蛋白不會表達,小鼠也不會呈現害怕行為。

接下來的兩天,食物中不給四環黴素,讓神經細胞上的視紫質通道蛋白有機會表現。再接下來的一天,才在另一個行為箱B中給予恐懼制約,讓小鼠在這行為箱中學到聲音和電擊連結而感到恐懼。這樣的小鼠不僅學到對電擊的恐懼,特別的是,負責恐懼學習的神經細胞被視紫質通道蛋白標定了。也就是說,恐懼學習的烙痕細胞被標定了。
 
以時間軸呈現學習和記憶過程中神經細胞被標定及活化的時機。
▲以時間軸呈現學習和記憶過程中神經細胞被標定及活化的時機。
接下來就是關鍵結果的呈現,連續5天把小鼠放回行為箱A,觀察小鼠的恐懼記憶行為。剛開始小鼠跟先前在行為箱A中的情形一樣,並不會感到害怕。若透過光纖給予特定波長的光線,令人興奮的結果出現了—小鼠出現害怕不敢動的行為。然而,若光線不在時,害怕的行為便不再出現。光線再啟動,害怕行為又出現。也就是說,用光線活化恐懼學習的烙痕細胞,恐懼記憶的行為就出現了。
 
透過光纖給予特定波長的光線,小鼠出現害怕不敢動的行為。光纖關閉時,害怕的行為便不再出現。光纖再啟動,害怕行為又出現。
▲透過光纖給予特定波長的光線,小鼠出現害怕不敢動的行為。光纖關閉時,害怕的行為便不再出現。光纖再啟動,害怕行為又出現。


真的是因為活化恐懼學習時對應的神經細胞,就引發恐懼的記憶行為嗎?科學家做了很多的小心求證。首先,還記得在小鼠齒狀回埋入的光纖嗎?如果透過光纖激活的不是恐懼學習的烙痕細胞,那麼也不會有恐懼記憶的行為出現。例如,在一模一樣的情境下,如果不給電擊,即使有神經細胞被基因標定,但和恐懼學習無關,那麼光纖即使激活這些細胞,也不會有恐懼記憶。

再者,如果在另外一個情境學習,即使神經細胞被標定,這些細胞雖然也能被光纖激活,但不會造成恐懼記憶。也就是說,特定的情境學習活化特定一群的神經細胞,不會混淆。

這研究利用光遺傳學法首度提出了恐懼學習的充分條件—直接活化一群參與記憶形成的細胞,就能誘發記憶行為。這個研究呼應了過去的結果,告訴我們一群特定的神經細胞是記憶烙痕的細胞基礎,而且特定的學習有特定的細胞來因應。

然而學習有不同的面向,整個學習過程中有不同的線索都足以誘發記憶,完整的記憶可能由幾個不同的記憶烙痕共同表徵。光遺傳學法提供了一個利器,在未來或許可以幫助科學家逐一定出記憶烙痕的各部分,以及它們之間的相互關係,而讓我們對於整個記憶烙痕有更全盤的了解。

深度閱讀
  1. Liu, X., S. Ramirez, P.T. Pang, C.B. Puryear, A. Govindarajan, K. Deisseroth, S. Tonegawa (2012) Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature, 484 (7394), 381-385.
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