幹細胞的故事知多少

 
2018/04/12 羅時成 | 長庚大學生命科學系     654

誘導性多功能幹細胞技術的理論基礎,簡單地說有三部曲:古典實驗胚胎學、從複製蛙到複製羊的突破、分子生物及基因導入細胞技術的成熟。

 

人才輩出的德國實驗胚胎學家

早期生物學家對多細胞動物如何由一個受精卵發育成成體,提出過許多假說。其一是「先成說」(preformation),認為精子內有一小人的雛形,精子與卵子結合後,小人逐漸發育。

19世紀末期(1888年)德國動物學家威爾漢‧魯(Wilhelm Roux)以青蛙的受精卵做實驗,等受精卵分裂成兩個細胞時,以燒紅的解剖針刺死其中一個細胞,觀察胚胎是否繼續發育。結果他看到實驗胚胎發育成半邊的蝌蚪,是支持「先成說」的證據,認為蝌蚪形狀早在受精卵內就固定了,破壞一個細胞,另一個活細胞只能發展出半邊蝌蚪。

 

德國另一位生物學家漢斯‧杜里舒(Hans Dreisch)與魯是赫克爾(Ernst Haeckel)的同門學生,1892年他利用海膽做為研究胚胎發育的材料。他的做法與魯不同,是在受精卵分裂成兩個細胞時,把兩個細胞分開。若「先成說」正確,分開的兩個細胞會各自發育成半邊胚胎,結果兩個細胞各自發育成完整的個體(雖然體形稍微小些),等於否定了「先成說」,同時開創探討「細胞的全能性」研究,即分析胚胎到什麼時期分離出的單一細胞仍保有發育成完整個體的能力。

之後,另一德國胚胎學家漢斯‧司培曼(Hans Spemann)重複魯的實驗。他不是把細胞刺死,而是在青蛙受精卵分裂成兩個細胞時,小心地用嬰兒頭髮打結把兩個細胞分開,結果與杜里舒的實驗相同,兩個細胞各自發育成為蝌蚪。於是對魯的實驗結果的解釋是:死去的細胞附著在另一細胞上,會抑制它發育出另一半個體的機會,但兩個細胞完全分開後,因各自都有「全能性」,所以能發育成蝌蚪。

 

因此胚胎學家就想知道,受精卵分裂成4個細胞時,一個個分開是否仍能發育成完整的蝌蚪?胚胎發育到哪個階段,分離出來的單一細胞才失去「全能性」,無法發育成一個完整個體?而正常的胚胎細胞又如何分化成不同胚層?不同胚層又如何發育成不同組織、器官?

 

受精卵持續進行細胞分裂,稱為卵裂期(cleavage),由於胚胎大小不變,因此子細胞愈來愈小。到達四千多個細胞時,胚胎中間形成一個空腔,稱為囊胚腔(blastocoel),胚胎稱為囊胚(blastula)。囊胚期的特色是細胞數量增加但沒有運動移位。

然後在灰月區產生裂縫,稱作背脣,許多細胞開始移位,從背脣鑽入內部,也造成背脣向兩側裂開形成側脣和腹脣。細胞往內移動造成了新的空腔,這空腔是最原始的腸道,因此稱這期的胚胎為原腸期(gastrula)。這一期的重要特色還有3個胚層(外胚層、中胚層與內胚層)的形成。之後,胚胎由圓形慢慢拉長,頭尾成形,3個胚層開始分化成不同組織與器官。

 

早期胚胎學分成描述胚胎學和實驗胚胎學:前者利用肉眼、放大鏡和顯微鏡觀察青蛙胚胎發育的變化,做詳實的紀錄,例如心臟何時開始形成?心臟又何時跳動?後者則是利用顯微手術破壞、切割、移植後,觀察胚胎發育有何異狀,或利用染劑染某一個細胞,追蹤該細胞成為後期胚胎的哪部分組織。在這段時期,胚胎學家已經建立胚層(外胚層、中胚層與內胚層)形成的紀錄。

 

學者知道精卵結合後,受精卵細胞未分裂前就會形成所謂的灰月區,那是因為精子進入卵子時會誘導卵子膜下方黑色素顆粒朝向精子進入的點移動,部分未移動的黑色素顆粒便在原來位置形成灰月區。受精卵第一次卵裂是縱分裂,把灰月區一分為二。實驗發現遭受人工分離的胚胎細胞若不含灰月區,就無法發育成完整個體,顯示灰月區在青蛙發育中的重要性。

 

連體蝌蚪和複製蛙

1924年,司培曼與學生希爾德‧曼戈德(Hilde Mangold)一起進行了一個重要的實驗。他們把一個原腸期胚胎的背脣(在灰月區形成的構造)以顯微手術移植到另一個相同時期胚胎背脣的對面,結果這個胚胎發育成連體蝌蚪,證明背脣細胞具有完全能力誘發周邊細胞形成一個個體,於是背脣被定義為「初級的組織者」。

 

後來,司培曼做了另一個實驗,把胚胎一邊的眼杯移植到另一胚胎尾端,誘發形成眼睛。他稱眼杯為「二級組織者」,因它無法誘發整個胚胎形成,只能誘發上皮細胞分化為晶狀體與眼杯,形成完整眼睛。司培曼研究胚胎學的成就使他在1935年獲得諾貝爾生理醫學獎。

 

在探討「細胞的全能性」時,司培曼另外做了一個經典實驗。他以頭髮打結的技術,把剛受精的蛙卵分成只有細胞質的部分,和同時含有細胞質及細胞核的部分。後者可進行細胞分裂,當胚胎擁有16個細胞時,他把髮結鬆開,使細胞核進入無核的細胞質,再把髮結打死,於是分成一個細胞及15個細胞兩種不同的部分。結果兩者各自發育成兩隻蝌蚪,雖然一大一小,但這個實驗建立起胚胎細胞核具有「全能性」的概念。

 

他的學生曼戈德為了證實「細胞核具有全能性」這個現象,嘗試發展「細胞核移植」的實驗,就是以毛細管針吸取細胞核再接種到去除細胞核的卵子裡,看它是否能發育成蝌蚪。可惜他因病去逝未能把這個技術發展成功。

 

1952年,兩位美國生物學家羅勃‧布瑞格(Robert Briggs)和湯瑪斯‧金恩(Thomas King)報導利用「細胞核移植」技術的實驗,成功地把囊胚期細胞核移植到無核卵中使它發育成蝌蚪,證明了細胞核具有全能性。由於囊胚期的細胞尚未分化,這時細胞核具有全能性應屬合理。他們後期的研究發現,晚期的胚胎細胞核漸漸失去全能性,對於已分化的細胞是否仍保有全能性採取較負面的看法。

 

1962年,英國動物學家約翰‧戈登(John Gurdon)利用不同種的青蛙,取得蝌蚪腸細胞的細胞核接種到無核卵裡使它發育成蝌蚪,最後發育成第一隻複製青蛙。戈登證明體細胞仍具全能性,顯示細胞分化並未失去任何遺傳物質,只是基因受到不同的調控,細胞表現不同特性。比如肝細胞打開肝細胞所需的基因、關閉了分化成其他細胞所需的基因,而非把不需要的基因丟棄。

 

複製兩棲類動物成功的實驗激起了動物學家對複製哺乳類動物的興趣,可是三十多年沒有成功,科學家開始懷疑細胞核全能性只發生在低等脊椎動物中。直到1997年,蘇格蘭科學家伊安‧魏爾邁(Ian Wilmut)成功地創造了複製羊桃莉,才打破了哺乳類細胞核沒有全能性的迷思。

 

複製羊的成功在於細胞核移植技術的改進。首先不用毛細管針把乳腺細胞核送入無核卵,而是採取電融合方法以減少對無核卵的傷害。其次是讓乳腺細胞處於營養饑餓狀態,使細胞核內的遺傳物質不進行複製。複製羊的成功帶領各類哺乳動物的複製成功,包括牛、貓、小鼠和猴,雖然成功率不同。由於桃莉比一般羊的壽命短,也開啟了移植細胞核染色體端粒變短導致壽命較短的研究。

 

幹細胞研究的歷史

 

複製羊成功的另一背景是生殖生物學技術的成熟。人類第一個試管嬰兒於1978年誕生。在小鼠研究方面又有融合胚胎的實驗,也就是混合來源不同的胚胎,生產出白毛與黑毛混雜的後代,進而有利用胚胎幹細胞進行基因轉殖鼠的研究。科學家對幹細胞的了解部分來自再生的研究,胚胎學有一分支是動物再生,最常用的實驗動物是扁形動物的渦蟲。

 

渦蟲成體約3~5公分,具有神經、肌肉及生殖系統;前端頭部呈三角形,具有兩個紅色眼點,可感覺光的刺激。若把渦蟲切成兩截,頭部可以長出尾部成為完整的渦蟲,尾部也可以長出頭部成為完整的渦蟲,再生能力甚強。若把渦蟲分成3截,每段都可再生成完整個體,中間那段可長出頭部與尾部。這現象讓科學家了解渦蟲細胞具有「多能幹細胞」性質。身體切下的組織,其中的細胞可依所在位置先分裂再分化成神經或肌肉細胞,甚至把頭部做縱切割而不分離,最後可以形成雙頭的渦蟲。

 

一般哺乳類幹細胞分成胚胎幹細胞與體幹細胞。幹細胞若來自胚胎,分化成各類細胞的潛力高,因此胚胎幹細胞又稱為「全能幹細胞」。幹細胞若來自骨髓,可以分化成各類血球細胞,包括紅血球、白血球和血小板,但無法分化成肌肉細胞和肝細胞,稱為「多能體幹細胞」。

 

在醫學上,以移植骨髓來治療遺傳性疾病就是一種再生醫學療法,始於1960年代左右。骨髓移植需要確認捐贈者與病患細胞表面抗原可相容,而且手術對捐贈者難免有一些風險,因此儲存臍帶血幹細胞的新興行業於21世紀初如雨後春筍出現,有如買保險,必要時儲存者可用自己的幹細胞進行醫療,避免免疫排斥的問題。

 

複製蛙與複製羊的研究證明體細胞的基因程式是可以「重新編程的」,但是哪些基因可以重新啟動胚胎發育的基因?類似的問題是:胚胎幹細胞又如何維持它的全能性呢?

 

山中伸彌為了解開這些謎,先用小鼠胚胎幹細胞做研究,發現有24個基因是維持幹細胞特性的必要基因。接著他把幹細胞必要基因導入小鼠纖維母細胞,居然可以讓體細胞轉變成多功能幹細胞。然後他用消去法,分別送基因進入纖維母細胞,最後發現4個轉錄因子Oct3∕4、Sox2、c-Myc和Klf4是讓體細胞變成幹細胞的關鍵。

2007年他宣布把那4個基因植入人體皮膚體細胞也可以誘發成多功能幹細胞(induced pluripotent stem cell, iPSC),於是這個技術紛紛被各實驗室應用,開啟了iPSC研究領域。那4個基因後來被稱作「山中伸彌因子」,並使他與戈登共獲2012年諾貝爾生理醫學獎。

 

iPSC的應用

 

2016年年底,《自然》(Nature)發表了日本東京農業大學的尾畑團隊利用iPSC技術培養出成熟卵子,並使它受精發育成小鼠的論文,震驚世界。誘導性多功能幹細胞可以分化成各類體細胞,如神經細胞、心肌細胞和血球細胞,再生醫學就是利用這一項技術進行醫療的方向。

 

日本一些實驗室研究如何使iPSC成為精子或卵子,這個比一般體細胞更加困難繁瑣。幹細胞的染色體都是雙套,如何使它們進行減數分裂形成精子、卵子?先要在試管建構精巢或卵巢。日本兩個研究團隊突破困難,在試管培養出精子與卵子,進而使它們受精發育成小鼠,可說是生殖醫學的一大躍升。也許這個成就將來可以應用於人類,使一些無法產生成熟精子或卵子的人透過iPSC技術生出具有他們基因的下一代。

 

人類疾病有些是先天的基因疾病,比如免疫不全的泡泡兒和鐮刀形貧血症者;另一大部分是因為老化,比如老人失智症和免疫力下降。基因疾病可透過iPSC技術和近年來發展的基因編輯技術得到矯正,一個例子是中國大陸浙江大學團隊以聽障人的iPSC分化成類似聽毛的細胞,將來或許可植入病人解決聽障問題。

 

細胞療法用來治療各種疾病或缺失是未來趨勢,包括癌症、牙齒再生、白髮禿頭,甚至可以客製化心臟。但目前最大的瓶頸在於如何在試管內生產足夠量的細胞,更別提生產出有功能性的心臟。科學家已成功地把小鼠iPSC接種到異體生物產生器官,哪天或許可把人類的iPSC種入豬體生產出客製化的心臟,然後移植到病患體內。未來人類養豬不單單是食用,豬可能變成培養人類心臟、肝臟和腎臟的載體,而人類臟器汰舊換新就成為司空見慣的事了!

 

生物無法永生,老化、死亡是生物的宿命。人類的體細胞也有一定的壽命,死亡的紅血球就由骨髓幹細胞增生分化成新的紅血球補充。幹細胞是否可以永生不死呢?如果是這樣,人老了就不會生白髮、變禿頭了。利用iPSC培養毛囊細胞再移植可以解決白髮、禿頭的問題,若科學家可以讓毛囊幹細胞永生不死,就可以省去試管培養幹細胞的過程。

 

50年前科學家曾經做過把年輕鼠的血注入年老鼠的實驗,發現可以改善年老鼠老化的現象。後來,科學家進行年輕鼠和年老鼠連體的實驗,使兩者血液循環互通,結果年老鼠回春現象更加顯著,白毛由新長出的黑毛取代了!科學家希望能找到年輕鼠血液中的回春因子或細胞,如果這個謎能夠解開並應用到人類,未來人類平均壽命超過百歲應該不是問題。