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石斑魚的病毒性疾病

101/04/05 瀏覽次數 28535
在臺灣,石斑魚是常見的桌上佳餚,也是節慶宴客中的高級食材。在外銷方面,中國、香港的石斑魚市場一直都供不應求。農委會表示,自民國98年起推動石斑魚產值倍增計畫以來,臺灣不僅產值已居世界第一、產量也居第二,且海峽兩岸經濟合作架構協議(ECFA)簽訂後,民國102年的石斑魚產值可望達到新臺幣76億元的目標。

雖然石斑魚苗孵化率可高達80~90%,但受到病毒感染、環境不良的影響,魚苗育成率可能低於1%,造成養殖成本攀升。疾病問題若不解決,石斑魚產業的發展便會受到限制。

臺灣的石斑魚養殖產業分工細密,餌料生物也都有專門的養殖場,只是因土地狹小,養殖區又密集,放養密度過高,上、下游養殖戶水道連通,且進、排水設計不良,疾病容易傳播。因此,要養殖經濟價值高且品系優良的石斑魚,就得發展有效的檢測和防治疾病技術。

感染途徑

目前石斑魚最主要的病毒感染性疾病,有神經壞死病毒與石斑魚虹彩病毒兩種。石斑魚苗從孵化開始至40天內,容易被神經壞死病毒感染,使得神經系統遭到破壞,死亡率高達90%。而從吋魚生長至成魚時,容易受到虹彩病毒感染,造成組織器官病變,死亡率約60%。受到病毒感染而未死亡的魚隻會成為帶原者,持續傳播病毒。

神經壞死病毒有垂直感染與水平感染兩種途徑,病毒可由親魚的體液直接傳遞給受精卵,造成仔魚一孵化就帶有病原,並感染同池魚隻。發病時,魚苗體色變黑,且因無法平衡造成泳動時不正常的旋轉,最後腦部與視網膜產生空洞,使細胞壞死而死亡。

虹彩病毒的主要傳播途徑是水平感染,感染初期沒有明顯特徵,每天僅死亡數條,但死亡率會漸漸增加。水質不佳時,幼魚感染率可達100%,且可能成為帶原魚而感染同池魚隻。嚴重時,體色也會變黑,脾臟和前腎會明顯腫大,後腎微微腫大,腹部偶爾可見出血點,鰓部充血或出血,鰓絲血管的結構凌亂且充滿肥大細胞,可能導致鰓部氣體交換受阻。

檢測方法

由於水體傳播魚類病毒感染的速度快,只要有1條魚染病,整池就難以倖免。快速且準確地檢測出疾病,可以初步控制疾病的散播,而越早偵測出病毒,就越容易減少整池魚發病帶來的損失。因此,開發簡便快速、靈敏度高、專一性強的檢測方法非常重要。目前魚類病毒性疾病的檢測,主要是使用分子生物學檢測技術和免疫檢測技術,來鑑別病毒特殊的遺傳物質或蛋白質。

分子生物學檢測技術是藉由核酸鹼基配對的特異性,偵測特定DNA片段的技術。首先篩選具有特異性的DNA片段做為探針,並標記放射線、螢光或酵素呈色等可判讀的物質,再與病原DNA雜合反應後,若在已知分子量大小處顯影或呈色,就可以判斷其病原種類。以下分別簡述4種方法的檢測原理。

利用1983年穆里斯(Kary B. Mullis)發明的聚合酶鏈反應技術,使用一對引子把病毒的DNA或RNA反轉錄後的cDNA擴大表現,便容易檢測出病毒。若選擇合適的循環數,配合膠體電泳分析,分離不同片段的大小,就可以得到相對的定量值。以神經壞死病毒為例,偵測極限可以到102 TCID50/ml。(tissue culture infection dosage, TCID)使用第一次聚合酶鏈反應的產物為模板進行第二次聚合酶鏈反應,可偵測的極限會更高。

即時定量聚合酶鏈反應技術是利用DNA結合特殊螢光染料,在聚合酶鏈反應過程中不斷地嵌入產物內,並用電腦在每個循環即時偵測螢光訊號的強度,以得知聚合酶鏈反應產物累積的程度。分析螢光強度與聚合酶鏈反應循環數的關係,與已知量的標準DNA比較,就可以進行定性與定量分析。以神經壞死病毒為例,偵測極限可以到101 TCID50/ml。

微流體即時定量聚合酶鏈反應技術是即時定量聚合酶連鎖反應技術的改良,目的是縮小體積使其具可攜帶性。例如由成功大學陳宗嶽及李國賓二位教授共同研發的微流體晶片系統,配合生物晶片技術,把混合反應槽、加熱反應槽、分離管道與偵測容槽集中在一片微陣列晶片上,可以快速且準確執行溫度的循環控制,偵測極限最低可至10 copies/μl,反應時間只需2.5個小時。

另外,恆溫圈環形核酸增幅法只需在攝氏60~65度的恆溫狀態下,便能利用引子與核酸聚合酶快速地增殖目標核酸。起始反應需要上、下兩對引子辨認模板核酸的6段序列,才能進行後續反應。這方法具高專一性且反應不需循環升降溫步驟,反應所需時間較聚合酶鏈反應短,且只需水浴槽或乾浴槽就可以操作。此外,肉眼就能判讀,加入螢光染劑則可使靈敏度提高。

免疫檢測技術則是利用抗原與抗體的特異性結合反應來檢測病原。若以病毒的結構性蛋白質為抗原,可檢測出檢體中是否含有病毒。若以病毒的非結構性蛋白質為抗原,則能檢測病毒是否處於複製期。以下分別簡述兩種方法的作用原理。

酵素連結免疫吸附法是以化學鍵結方式把酵素標記在抗體或抗原上,利用抗原與抗體之間具有專一性的鍵結特性,配合酵素連結的呈色反應,依照待測物的顏色深淺,進行定量或定性分析。這方法的判讀需要較精密的儀器,花費較高,但可以設計成類似驗孕試紙的方式,利用顯色有無來判讀,操作十分簡便。以神經壞死病毒為例,偵測極限在104~105 TCID50/ml。

免疫磁減量技術是筆者實驗室與臺灣師範大學楊謝樂教授合作開發的,磁珠主要成分是Fe3O4,把抗神經壞死病毒的抗體標記在磁珠上,磁珠的大小約65 nm,在試劑中可以很均勻地分布,同時讓磁珠有一個電場令其旋轉,並測量其旋轉的磁當量。當測試樣本沒有病毒時,其旋轉速度最快。當磁珠與病毒結合後,磁性會減弱而造成磁減量,把這微弱的磁訊號轉變為可量測的電壓,便能透過磁珠轉動速度來偵測神經壞死病毒量。不同量的病毒接合在磁珠的抗體上,會造成不同程度的旋轉速度減緩。

若已建立神經壞死病毒標準曲線,放入待測物後1個小時就可經由機器自動判讀結果。以神經壞死病毒為例,最低可以偵測到20 TCID50/ml以下的病毒量,且專一性強。

在養殖現場,疾病檢測方法不只要追求快速、靈敏度高、專一性強,還要沒有技術門檻、方便取得、價格低,才容易在產業界推行。

防治方法

針對特定病原開發疫苗,是目前防治傳染性疾病的有效方式。依施用方法有注射、浸泡、口服等,依製作方式有弱毒化疫苗、不活化疫苗、次單位疫苗、核酸疫苗等。疫苗注射前須以藥物麻醉,目前多使用自動化免疫注射器;浸泡型疫苗對魚類雖有作用,但魚體容易受緊迫,而且注射與浸泡方式的人力成本較昂貴。

口服型疫苗則直接把疫苗沾附或包埋至餌料中,使用更方便,造成的緊迫小且適用於幼魚,但腸胃道酵素會破壞抗原,而無法誘發免疫作用。不過,如果利用微脂體、藻膠或生物膜包裹疫苗,使它不被破壞,則有利於疫苗的順利吸收。

筆者實驗室與中央研究院吳金洌特聘研究員利用核醣核酸干擾技術發展抗神經壞死病毒的水產疫苗,當疫苗順利被魚體吸收後,會在細胞內產生小片段雙股RNA,與蛋白質聚合體及RNA分解酵素結合後,遇到同源性的mRNA就會把它降解,使它無法轉譯出蛋白質。以微脂體混合飼料餵食後發現,能成功地把核醣核酸干擾帶入體內,使其在魚體內產生抗病毒的效果。

成功大學楊惠郎教授的研究團隊以包埋轉殖能表現神經壞死病毒基因的大腸桿菌餵食豐年蝦,再利用食物鏈的方式做為口服疫苗直接餵食石斑稚魚,可以保護石斑稚魚對抗神經壞死病毒的感染,在田間測試也證實有效。

中山大學林全信教授的研究團隊利用大腸桿菌建立重組石斑魚神經壞死病毒外鞘蛋白,形成類似病毒顆粒,以肌肉注射方式施打可發揮保護效果。

臺灣海洋大學周信佑教授的研究團隊和農委會水產試驗所海水繁養殖研究中心合作,在免疫母雞上注射石斑魚病毒,由雞蛋中取出蛋黃製作抗病毒IgY,再以多重相乳化包埋,製作抗石斑魚神經壞死病毒及抗石斑魚虹彩病毒的IgY蛋粉,具有一定的保護效果,安全性高且成本低。

家畜衛生試驗已開發出石斑魚虹彩病毒的不活化疫苗,使用腹腔注射,適於10公克以上的石斑稚魚。田間試驗結果顯示對於點帶石斑及龍膽石斑都有保護效果,即將通過國家認證成為全臺第一個合法上市的疫苗。目前,在政府的支持下,已研製100萬劑量免費供養殖戶使用。

相同抗原在不同魚種上,也可能有不同的免疫保護效果。研發具廣效的病原覆蓋率以提供周全的保護,並對魚體、環境、人體都具有高安全性且符合成本的水產疫苗,是產業界與學術界一直努力的目標。

另外,免疫刺激物如脂多糖、幾丁質、天然物萃取或益生菌,可以增強魚體免疫力。例如,在飼料裡添加金針菇萃取物,因其含有多醣體及免疫調節蛋白,濃度高時可強化魚體免疫力,且長時間餵食並無危害。蕈菇、中草藥、珊瑚等都可以萃取出增強魚體免疫的物質。金針菇雖然較便宜,但以目前的萃取技術,成品價格還是偏高,難以實用。而直接在水體中加入益生菌,可以調節與刺激水產生物免疫功能,並維持環境中微生物的平衡,提升成長率、存活率及抗病能力,維護生物的安全性。

健康管理很重要

但疫苗並非萬靈丹,尤其是神經壞死病毒好發於石斑魚幼苗,魚體在出生後12天內免疫系統尚未發育完全,而一般疫苗攝入後免疫系統需3周才會到達高峰,因此必須配合環境控制,隨時監控養殖場是否有病原入侵。養殖場要有一套統一的標準作業流程,且與水產試驗機關密切配合,定時檢測以降低發病率。

養殖場內的器具須定期消毒、滅菌,洗卵是目前防止垂直感染的最佳方式。買進魚苗前須先檢測病原量,活體餌料如牡蠣受精卵、輪蟲、豐年蝦、橈腳類等都可能是病毒的帶原者。同時,必須定期檢測水質及魚體是否帶有病毒,畢竟預防勝於治療。

良好的水質環境可以減少緊迫、降低發病率,減少養殖密度則可以降低魚體互相碰撞的機率。定期篩選魚隻、大小分缸避免殘食,每一區塊有物理隔離,才符合生物的安全性。此外,水循環系統不能共用,以避免病原的流通,且帶有病原的水不可隨意排放,避免病原流出。

病毒的存在不是短時間造成的,臺灣早就是疫區,因此最重要的是預防疾病的爆發。只要有良好的管理,魚苗能成長至銷售體型,石斑魚產業仍然值得投資。

控制進水與排水系統、隔離病原,都需要水利工程設計。活魚運輸的工具也需特殊設計,以增加溶氧。產業廢棄物如魚皮與魚骨的加工利用,可帶來附加價值。因此,養殖業需要有更多不同領域的人才投入,並與其他產業連結以增加產值。此外,減低養殖密度,劃分土地及水資源,使產業精緻化,養成高產值的石斑魚,並且充分利用資源與維持生態環境平衡,才能使養殖產業永續發展。
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