畜產生物科技：性別鑑定
92/12/10
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蕭振文｜
行政院農業委員會畜產試驗所生理組
東方的民族普遍認為男性擔負傳宗接代的重責大任，所以多少存在重男輕女的觀念。為了達成此天賦使命，不管是民間偏方或是另類醫學，甚至藉由宗教神力，不外乎想掌握生兒育女的自主權。目前，人類應用性別鑑定技術，主要是希望在胚的早期發育階段，即能診斷出性聯遺傳的疾病並有效地加以預防，避免生出有遺傳缺陷的嬰兒。在畜產動物方面，應用性別鑑定技術來選性繁殖，則具有重要的經濟價值。例如酪農需要母牛來生產牛乳，而供應精液的種畜公司，則期望獲得品種優良的種公畜來生產精液。因此，性別鑑定技術不論應用在人類或是畜產動物，均具有重要的意義與價值。
性別鑑定的方法
生殖細胞的性別鑑定，可以藉由精子與著床前的胚來著手。精子的性別鑑定，可利用精子分離儀來篩選帶有Y-或X-染色體的精子。其原理是帶有X-染色體的精子所含的去氧核醣核酸（DNA）較帶Y-染色體的精子為多，利用能夠與精子頭部DNA結合的螢光染色劑處理後，藉由產生的螢光量高低差異而加以分離篩選。目前已應用在體外受精系統中，雖然精子分離儀的分離效率每秒可達五千隻精蟲（每小時約一千八百萬隻），分離的準確性亦達90％以上，然而其分離效率尚有極大的改進空間，特別是在可提升分離速度的高速噴頭方面的改良。在國外，目前精子的分離仍局限於研究測試及小規模的動物試驗階段，將來如果能改良精子分離儀的效能，進而大幅降低分析成本，在畜產動物領域將極具應用潛力。
著床前動物胚的性別鑑定方法有數種，包括：染色體圖譜分析、存在於雄性動物胚表面H-Y抗體的測定、X-染色體酵素量的測定及利用Y-染色體特異探針進行雜交反應等。這些方法在實際應用時，卻面臨了試驗步驟繁瑣、準確性及敏感度不足、需要特殊技術及儀器設備等因素而不易實際應用。近年來，因為分子生物技術的快速進展，加上聚合酶連鎖反應技術的發明，使原本極為微量的DNA樣品，能夠在數小時的反應時間內大量的複製，因此只要應用顯微操作技術，抽取少許的胚葉細胞進行聚合酶連鎖反應，即可快速準確地分析出胚的性別，達到控制家畜後代性別的目的。
染色體圖譜分析，是根據雄性動物的性染色體是XY，雌性動物的性染色體則是XX。採集部分的胚葉組織，經過培養後固定有絲分裂的細胞，進行細胞核的染色體標本製備，再根據呈現的XX、XY染色體組合來判定胚的性別。
H-Y抗原是雄性哺乳動物細胞膜所特有的蛋白質，雌性動物的細胞膜上沒有這種抗原。檢測胚的細胞膜上是否存在H-Y抗原，即可鑑定胚的性別。利用這種免疫學方法進行性別鑑定又可分為：
細胞毒性法 將胚培養於添加補體和H-Y抗體的培養液中，觀察胚能否存活。如果胚含有H-Y抗原，會產生免疫反應，使胚的發育受阻或發生溶解死亡，此即為雄性胚。如果不含有H-Y抗原，則胚可以持續發育，此即為雌性胚。此方法的缺點是雄性胚將受到破壞而致死，無法保留有價值的雄性胚。
間接免疫螢光法 由於上述細胞毒性法的缺點，科學家研發使用螢光染色劑來標定檢測的抗體。首先將包覆在胚外圍的透明帶去除，將胚葉細胞與H-Y抗體一起培養，然後再與螢光染色劑標記的第二抗體共同培養，最後利用螢光顯微鏡檢查螢光的產生與否。會產生螢光的胚是雄性胚，反之則為雌性胚。本法的優點是不會破壞雄性胚，也不會影響胚的存活。
X-染色體酵素量的測定是雌性胚的性染色體組合為XX，較雄性胚多一個X-染色體。因此測定在X-染色體上特定酵素的含量差異，即可判定胚的性別。
部分的研究指出，哺乳動物胚的發育速率具有性別的差異性。利用體外培育技術生產的試管牛胚，發現在胚發育早期階段雄性胚的發育速率比雌性胚快。而體外培育的小鼠胚也發現有相同的現象。為增加母牛排卵數目先以促進卵巢排卵的激濾泡素荷爾蒙處理，進行配種授精後第七天再將這些胚沖洗出來，結果發現發育較快的胚中約有70％是雄性胚，而發育最慢的胚中約有70％是雌性胚。
在哺乳動物已發現一些僅存在於Y-染色體上的DNA序列，例如Sry基因，是睪丸決定因子。這些DNA序列可以做為胚性別鑑定時雜交反應的探針。利用顯微操作技術抽取少許胚葉細胞，與經過標定的探針進行雜交反應，最後由有無呈現雜交訊號來判定胚的性別。
聚合酶連鎖反應是一種在試管內反應的技術，可以將某一特定的DNA進行增殖。本法利用X-與Y-性染色體上DNA組成的差異，篩選出只存在於Y-染色體上的DNA序列，提供進行聚合酶連鎖反應時黏接到雄性胚的性染色體上，進而複製出只存在於雄性胚的DNA產物，此一小段DNA即稱為引子。引子是單股的DNA序列，可與模板上的DNA序列互補。
在進行聚合酶連鎖反應性別鑑定時，所需要的基本材料包括了性染色體上的DNA模板、DNA聚合酶、去氧核酸三磷酸、引子及反應時所需的緩衝液等。在適當的反應條件下，引子可黏合到已加熱變性成單股的DNA模板上，配合DNA聚合酶的作用及各種反應物以進行DNA的增殖。反應時，DNA的合成一直重複，每一個新合成的新股DNA即變成下一次反應時的模板，於是標的DNA序列不斷地增殖產製。
在利用聚合酶連鎖反應進行胚的性別鑑定時，因為偵測的胚葉細胞數很少，所以對敏感度的要求甚高。胚因為性別鑑定而進行顯微操作，多少會影響胚移置後的存活率。顯微操作後的胚經過冷凍再解凍，胚移置後的懷孕率較未經過顯微操作的冷凍胚低了約10％。目前國內經顯微操作後的冷凍胚，移置後的懷孕率約在40％以上。利用聚合酶連鎖反應進行胚的性別鑑定，所需時間大約為5～6小時，在這一段檢測的時間內，可利用體外培養系統進行胚的短時間培養，俟鑑定結果呈現之後再將胚移置到受胚母牛的子宮，所以不需要進行胚的冷凍，如此便可以提高胚移置的懷孕率，應用在酪農的牧場尤其適合。
我國行政院農業委員會畜產試驗所，應用聚合酶連鎖反應法，配合使用取自臺灣大學畜產研究所研發成功的Y-染色體特異引子，進行牛胚的性別鑑定。此一鑑定的程序是，針對受精後第6.5～7天的乳牛進行牛胚的沖洗與收集，但僅選取外型優良健康的一級牛胚進行性別鑑定。利用顯微操作抽取胚內的胚葉細胞做為模板DNA，進行聚合酶連鎖反應。聚合酶連鎖反應的步驟包括：攝氏94度加熱一分鐘，接著是重複50次的三段溫度循環，依序為（一）攝氏94度10秒，使性染色體的模板雙股DNA結構變性分開成為單股；（二）攝氏56度15秒，使引子與單股的模板DNA互補相黏；（三）攝氏72度10秒，在聚合酶的作用下進行DNA的複製，複製出一段與模板DNA完全相似的DNA產物。反應經過50次重複循環，即複製出250倍的DNA產物。
聚合酶連鎖反應之後，再進行膠片電泳分析。由於DNA帶著負電，利用同電相斥異電相吸、大分子DNA移動慢而小分子DNA移動快的原理，將聚合酶連鎖反應後的DNA產物分開。DNA產物經過電泳後，利用可與DNA結合並呈現橘色螢光的溴化乙錠進行染色，最後在紫外燈箱上觀察膠片上的DNA產物並判定胚的性別。若胚為雄性，膠片上會呈現複製的Y-染色體特異DNA片段，若不具此DNA片段則判定為雌性胚。利用本性別鑑定套組，複製出的DNA產物呈現388和518鹼基對二個片段者即判定為雄性胚（388鹹基對為雄性所特有，而518鹹基對則為公母胚所共有的特徵，此一特徵可用來確認實驗過程無誤），若僅呈現518鹼基對的片段則判定為雌性胚。
牛胚性別鑑定完成之後，即可將所需的胚移置到代理孕母的子宮，或是先予以冷凍保存在攝氏零下196度的液態氮中，在適當時機或有代孕母牛可用時，再將胚解凍並進行移置。
未來展望
各種性別鑑定的方法都有其優劣點，然而以最重要的準確率及鑑定效率而言，利用性染色體上特異DNA序列做為引子，配合聚合酶連鎖反應增殖DNA的技術，是目前應用在動物胚性別鑑定上最可行的方法，此法在敏感度與準確度上均相當高。目前，在先進國家已應用相關原理開發出商品化套組，如Finnzymes公司開發的Ampli-Y套組、日本Eiken公司開發的牛胚性別鑑定套組等，以提供業界實際應用。
性別鑑定技術應用在畜產動物，具有極為重要的經濟價值，尤其在酪農業上其效果更為顯著，這是因為乳牛的懷孕期長達10個月且為單胎動物，生下的仔牛因性別不同，其價值的差異有天壤之別。近年來，由於分子生物科技的進步，擴大了性別鑑定技術在動物應用上的可行性。在歐盟，牛肉的進出口貿易額每年高達數十億歐元之多，而生產高品質的公牛肉還可以獲得補貼，為了預防牛肉有摻雜造假的情形，並保障消費者的權益，歐盟也利用聚合酶連鎖反應進行牛肉的性別鑑定。
在牛胚性別經過鑑定實際操作時，影響鑑定結果的成敗關鍵在於操作者的經驗。利用顯微操作抽取胚葉細胞的技術熟練度，會影響性別鑑定後胚的存活率；而在進行聚合酶連鎖反應時，如何將可能的人為污染降到最低的程度，以提高鑑定準確率，亦攸關鑑定的正確與否，因此從事胚性別鑑定工作者，需接受完整的操作技術訓練。
對於酪農而言，牛胚經過性別鑑定之後，可以生產預期性別的仔牛，再配合妥善照料代孕的受胚牛，使懷孕及分娩的過程均能順利正常，以加速乳牛群的品種改良速度，提高牧場的收益與經營效率，有效地降低生產成本。當前國內利用胚移置技術以及借腹生子的方法生產乳牛，已經相當成熟且普遍的在民間推廣應用，今後若能將牛胚的性別鑑定與乳牛的借腹生子技術密切結合，必能提升臺灣酪農的國際競爭力。
