植物保護生技：基因工程蛋白質的生產–桿狀病毒表現系統
94/08/04
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趙裕展｜
中央研究院分子生物研究所
基因療法的新工具
桿狀病毒是一種桿狀、含有雙股DNA基因體的病毒，此病毒只感染節肢動物，但主要寄主是蛾蝶類昆蟲的幼蟲。長期以來，桿狀病毒被用來當作有效的蟲害防治微生物。由於防治的對象大都屬農作物，和人類的食物有關，各國都對這病毒做過嚴格的檢驗。在確認不會在人類細胞中從事病毒基因表現、繁殖，以及造成任何病原性後，已被世界各國批准成為作物蟲害防治的有效微生物製劑。
因為桿狀病毒有幾個極強的起動子（promoter），在1980年代初期即被開發成有效的外源蛋白質生產工具，從此成為極受歡迎的高品質蛋白質生產系統。在1990年代中，科學家陸續發現這病毒雖然不會表現自己的起動子，但若裝入可被人類細胞認識的起動子，則這病毒可進入少數人類細胞，如肝細胞，表現外源基因。由於桿狀病毒對人無病原性，也不會增殖，因此安全性比目前基因療法使用的腺病毒及反轉錄酉每病毒等人類病毒為高，將可運用在新興的人類基因療法上。
利用基因工程防治蟲害
桿狀病毒長期以來是蟲害防治的有效微生物，只是它的殺蟲效率雖高，但所須期間較長，在昆蟲死亡前，仍會嚼食過多的作物，而造成很大的損失。因此，若能以基因工程方法把有毒的基因，如蠍毒基因，植入桿狀病毒的基因體內，則當桿狀病毒在感染昆蟲，並表現蠍毒蛋白後，可在昆蟲體內快速製造蠍毒蛋白，而把昆蟲殺死，使得蟲害損失降低。
雖然昆蟲特異的蠍毒蛋白對哺乳類無毒，而且桿狀病毒也不會感染哺乳類動物，但把一個含有外源基因的桿狀病毒放入自然界或農業生態系中，仍有一定的風險，必須嚴密追蹤病毒的去處。傳統上病毒的偵測需要動用超薄切片及電子顯微鏡，處理過程非常麻煩。筆者的研究團隊曾經嘗試使用細菌的可顯色基因，含有這種基因所生產的蛋白質可染成藍色，也嘗試使用螢火蟲螢光基因，使蟲體產生螢光，但這兩種方法都必須把受質注射入蟲體，麻煩而不實際。
1986年筆者與同仁們發現把水母綠螢光蛋白植入桿狀病毒，可有效偵測病毒的散布。這種綠螢光蛋白只需以紫外光照射，即可以非破壞性的方式偵測病毒去處。這方法效果良好，是第一個可有效檢測基因工程病毒所感染的生物在作物上散布的方法，同時也可測試不同起動子在家蠶身上的蛋白質表現量。
生產基因工程蛋白質
傳統上，蛋白質的生產都是採用以桿狀病毒感染細胞株的方法，其好處在於較易純化蛋白質，缺點則是所有過程都必須以無菌操作，若需大量生產，必須購買貴重且精密的發酵槽，價格昂貴。在1985年，有人成功地以桿狀病毒感染昆蟲來生產蛋白質，筆者的實驗室引入綠螢光蛋白後，更可以清楚地得知蛋白質生產量的高低。由於臺灣擁有可觀的養蠶產業，氣候也極適合家蠶的養殖，十分有利於以家蠶從事基因工程蛋白質的生產。
以家蠶生產基因工程蛋白質有很多好處。第一、家蠶是最馴化的昆蟲，一旦逸入自然界便無法存活，這一點對基因工程的安全性十分重要。第二、家蠶不似其他昆蟲會自相殘殺，可以高密度飼養。第三、國人對家蠶極為熟稔，反而，歐美人士不甚熟悉這項生物科技，因此我們具有重大的優勢。第四、臺灣目前在桿狀病毒方面的基礎研究水準領先全亞洲。因此國人若要發展生物科技，以家蠶為生產平臺的領域不可忽略。
合成起動子
桿狀病毒向來都是以早期的ie1等起動子，以及極晚期的多角體素（polyhedrin）或p10起動子生產外源蛋白質。利用早期起動子所生產的蛋白質品質甚佳，但是產量低。利用極晚期起動子所生產的蛋白質產量雖高，但品質不好，而且若採用晚期起動子表現不穩定的蛋白質，此蛋白質很容易在細胞內就被裂解。
為了解決這問題，我們避開從基因體尋找起動子的傳統方法，把新發現的加強子配合外來的微量起動子，組成一個合成的起動子。所謂微量起動子，就是只含一般起動子末端約20～30個核酸左右的序列，形成一個可在加強子幫忙時才啟動的起動子序列。這種合成式起動子可以在病毒感染的早期即可製造外源蛋白質，但產量比利用早期起動子的效果來得高，直逼極晚期起動子，而且蛋白質的品質佳，沒有明顯裂解。
由於傳統的起動子都是從基因體中發現得到的，加上基因體計畫的盛行，絕大部分的起動子都已被發現，若能以合成的方法製造全新的起動子，將可開風氣之先。
非胞裂性桿狀病毒
桿狀病毒感染細胞後，會裂解細胞，因此，所生產的基因工程蛋白質會外逸到培養液。而且由於細胞裂解後會造成蛋白酉每外逸，以致無限制地破壞蛋白質，使得所生產的蛋白質品質降低，這是桿狀病毒在蛋白質生產上很大的缺點。
為了製造一個不會溶裂細胞的桿狀病毒載體系統，初期我們曾把桿狀病毒的p35基因去除，發現病毒可進入潛伏感染，同時會以非胞裂性的方法生產蛋白質。但由於去除p35後，病毒會持續刺激細胞進行細胞自戕，使得能生產外源蛋白質的細胞數量受限，無法成為一個有效率的蛋白質生產系統。
後來，我們發現綠螢光蛋白在細胞溶裂時會外逸，使得細胞喪失螢光，透過這種鑑別方法，可大規模地尋找不溶裂細胞的桿狀病毒。首先，我們以化學誘變劑讓桿狀病毒基因體全面性地發生突變，然後挑選在病毒感染細胞後，細胞仍能保存綠螢光的病毒株。這方法十分有效，在約五千多的突變株中找到了十幾株不溶裂細胞的桿狀病毒。這些病毒的起動子強度不亞於野生種病毒，但由於它們不會溶裂細胞，使得蛋白質的回收量大為提高，而且品質也變得更好。
細胞內分析蛋白折疊
蛋白質是否正確折疊，關係著其活性及多種主要的蛋白質特性。因此，若所生產的蛋白質無法正常折疊，則無法期望它會是有正常用途的蛋白質。在細胞內，不正常折疊的蛋白質不但沒有功能，有時候反而會造成嚴重的疾病，譬如異常折疊的普恩蛋白質會造成病變，狂牛病等即是明顯的例子。由於無法折疊或折疊異常的蛋白質會危及細胞的生存，細胞也常會使這些蛋白質沈澱或變成不可溶，或予以裂解、消化並吸收。在基因工程生產上，蛋白質的不正常折疊，往往造成產量降低或無法產出可用的蛋白質。
傳統上量測蛋白質折疊的方法是把蛋白質純化，再以吸收光譜等方法測出其折疊度。然而要純化蛋白質不但困難費事，而且純化的過程也可能破壞蛋白質。所以筆者的研究室開始評估，是否可能在細胞內直接研究蛋白質的折疊。
由於任何單一細胞內都含有數以千計不同的蛋白質，要得知某單一蛋白質的折疊更是難上加難。我們的做法是，在欲探測的目標蛋白質兩端分別加入一個藍螢光蛋白與黃螢光蛋白，利用藍螢光蛋白受激產生藍螢光後在100埃（一個埃等於 10－10 公尺）的距離內，會激發黃螢光蛋白之螢光的特性，以探索螢火蟲螢光蛋白折疊的好壞。
結果這方法相當成功，當目標蛋白質正常折疊或折疊鬆脫時，甚或被蛋白酶分解時，所發出的光譜都不相同。利用這種光譜的差異，不但可以研究蛋白質的折疊，事實上可以「觀看」細胞內特定蛋白質的折疊。這全新發展出來的方法，命名為「蛋白質的螢光胞內折疊分析法」。
我們利用這種分析技術，研究胞裂性及非胞裂性病毒所生產蛋白質的折疊，發現在細胞內，非胞裂性病毒所生產蛋白質的折疊情況較胞裂性的好。這方法適用的目標蛋白質甚多，效果一樣好。由於蛋白質折疊是一個生物學、病理學上重要的現象，很多基因突變所造成的遺傳疾病也是由蛋白質折疊錯誤所引起的。因此，這項技術勢必會在遺傳疾病的研究及新藥發現上，扮演一個重要的角色。
SARS病毒的模擬
嚴重急性呼吸道症候群（SARS），是由一種致命性的冠狀病毒所造成的，這病毒在2003年流行於世界各地，造成經濟、社會、以及人命上很大的損失。SARS病毒是一種傳染性甚高的病原，連在最嚴密控管的實驗室裡做研究都有很大的危險性，從新加坡、臺灣、一直到中國大陸都有科學家因為研究這病毒受到感染，甚至死亡。為了製造有效的疫苗，筆者及同仁們已成功地創造了一個類SARS病毒顆粒，它是一個無病原性的基因工程產物，由於類病毒顆粒有病毒的形體，其抗原性會比單一基因工程蛋白質所激發的更好。
使用桿狀病毒來共同表現SARS病毒的膜蛋白及套蛋白，發現能形成類SARS病毒顆粒。由於SARS病毒的蕀蛋白具有主要的抗原性，因此把能表達蕀蛋白、膜蛋白及套蛋白的桿狀病毒，拿來共同感染昆蟲細胞，結果可生成具有蕀蛋白的類病毒顆粒。這種顆粒具有SARS病毒的蛋白質活性，但是因為沒有SARS病毒的基因體，因此不具感染性，將來應該可成為最好的SARS疫苗。
創新研發 開創新局
桿狀病毒是只會感染昆蟲等無脊椎動物的病毒，不會感染人類。但由已發表的報告顯示，研究或利用此病毒的報告比研究人類病毒的報告還多，顯示它相當有用而受到重視。雖然長久以來，桿狀病毒已被利用成蛋白質表達的工具，若再多加改良，其效用將可以大幅提高。
此外，由於桿狀病毒的基因體可在昆蟲細胞內被改造，然後再加以釋出，以做為哺乳類細胞的基因轉殖或蛋白質功能分析的工具，使其用途大為擴增。再由於這病毒對人類無害，病毒自身的起動子並不會在哺乳類細胞內起動，病毒基因體也不會在哺乳類細胞內複製，因此安全性比目前基因療法所使用的哺乳類病毒高，將來應有極佳的前景。
20世紀是生物學大發現的世紀，一直延伸到21世紀初，人類漸次了解基因的組成，以及基因如何造成生命現象。這些「發現型」的研究固然沒有止境，但「創新型」的生物研究卻越來越趨重要。臺灣的科技和歐美國家有相當差距，因此受制於外國原創專利的束縛極為嚴重，創新型研究，尤其是高度原創的研發成果，是國人突破外人束縛的不二法門。
創新型研究可延伸人類的知識領域，幫忙進入以前無法探索的學門，可以創造更多更大的產業價值。以臺灣幅員狹小，物資缺乏，但民眾知識、教育水準甚高的情況下，創新型的基礎研究與應用開發，才是未來最值得追求的目標。
