每年歲末年初是大家忙著採買年貨的時節,其中南北雜貨,如魷魚絲、香魚片、蜜餞等是民眾爭相購買的應景食品。但是這些年貨大都是散裝或簡易包裝,並沒有食品衛生單位要求的法定標示,不知消費者是否注意到食用的安全性?沒有標示的食品,會令人擔憂是否貨真價實?是否有違法或過量的食品添加物,例如防腐劑、色素等?是否有不當的加工、流通過程?
由於市場上販售的魚介類多數未標明種別,而且加工後的產品也無法從外觀判斷其原料種別。倘若販售的是有毒魚介類,又不幸被消費者食用,則後果堪慮。
有報告指出,在墨爾本以每公斤15美元販售的鯛魚,其實只是每公斤4至6美元的廉價魚種。在佛羅里達州也有類似的情況,81件標示是紅鯛魚的魚片檢體,僅有30%被鑑定是真品。至於國內,在市售香魚片的毒性調查中,發現有11.9%的產品含有輕微河魨毒性,衍生出消費者食用安全的疑慮。河魨是日本人相當喜愛的食品,而河魨毒卻是一大困擾,因此河魨料理師傅需要通過嚴謹的廚師證照考試。但在臺灣這一制度尚未周全,因此近年來曾爆發數起河魨毒中毒案例,也導致國人喪失寶貴的生命。
為杜絕業者摻假謀取不法利益,造成食用安全的顧慮,水產品的來源物種鑑定實是刻不容緩。如何有效區分有毒和無毒的河魨種類及加工產品,顯得日趨重要。以基因法或蛋白質鑑定法都能有效判定魚種,本文說明十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和等電點聚焦電泳法(isoelectric focusing electrophoresis, IEF)的理論和操作方法,並介紹在後基因體時代的關鍵技術以及在魚種鑑定上的應用。
SDS-PAGE法
基礎理論 電泳是一種提供外加電場來分離帶電粒子,依粒子大小、電荷數、形狀等不同而有不同分離程度的技術。SDS-PAGE的原理是加入一種陰離子變性劑十二烷基硫酸鈉SDS,它會與大部分蛋白質產生疏水性作用,並以一定比例與蛋白質結合,使這些蛋白質失去本身的電荷,同時形成一形狀穩定且帶負電荷的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺蛋白質聚合物。因此在SDS-PAGE中,蛋白質的移動速率僅與本身分子量的大小有關,可據以判斷蛋白質的純度及其組成次單元的分子量。
操作流程 主要分3個部分,分別是蛋白質的抽取、電泳的分析和膠片的染色。首先取魚肉溶於適當體積的水中,經均質化、離心及過濾後,其上層液就是水溶性蛋白質。把樣品與樣品緩衝液混合加熱後,取適當體積注入樣品槽中,提供一外加電場,在固定電壓或電流下開始泳動。電泳後把膠片取出以考馬斯藍或銀染色,再去掉染劑,最後以目視法或用密度分析儀計算並分析其分子量組成。
IEF法
基礎理論 主要以樣品本身所帶的電荷來分離物質,與分子量大小無關,這個特性與SDS-PAGE不同。蛋白質是兩性物質,當淨電荷是零時,就是等電點。若外在環境酸鹼值(pH)與蛋白質的等電點相同時,蛋白質會停止泳動,因此可利用pH梯度來達到分離不同等電點蛋白質的目的。
操作流程 與SDS-PAGE相似,把低分子量的有機酸和鹼或電解質加入膠片配製液,使其成膠後經預對焦,即加入一外加電場,使膠片中的pH成梯度分布狀態,再把蛋白質注入這系統中。在外加電場驅動下,每個次單元蛋白質會停在一固定的pH點上,這時的pH就是蛋白質本身的等電點。隨著膠片上pH梯度不同,不同等電點的蛋白質會分布在膠片上不同位置,而達到分離的目的。
比較上述二種方法,IEF較SDS-PAGE有更佳的解析度,但操作繁雜,費用也較高,SDS-PAGE是最簡單常用的分析方法,且費用最低。
蛋白質體
蛋白質體(proteome)的觀念首度於1994年在二維電泳會議中提出,並在1995年闡述於學術期刊論文中。其後蛋白質體便成為各學術會議的熱門主題,每年有數百篇論文在著名期刊中發表。截至目前,美國國家醫學圖書館期刊文獻檢索系統(PubMed)中有關蛋白質體學的文章已近萬篇,包含回顧文章二千餘篇。
蛋白質體意指個體內所有被基因體(genome)表達的蛋白質,包括特定的細胞、組織、臟器等的基因經轉錄及轉譯產生的全部蛋白質。蛋白質體會受成長分化、外在環境、疾病、老化等影響而變化,因此蛋白質體學是以廣泛的角度,觀察生物體面臨生理轉變或疾病反應時,整體蛋白質定性和定量的變化,以及蛋白質間交互作用等表現情形,並非針對單一蛋白質進行研究,而是探討整個蛋白質體內蛋白質的所有變化。
蛋白質體學在生物學上的應用,最常使用的是找出具有「質」與「量」改變的蛋白質。許多疾病的產生並非單純是某一種蛋白質失調所造成的,而是整個蛋白質網絡發生改變所造成的。近幾年來,已逐漸建立很多單一細胞或組織的蛋白質體資料庫。
蛋白質體學的技術涵蓋很多層面,大抵上包含3大部分,即純化分離技術、生物質譜儀技術,以及後續電腦程式的蛋白質資料庫和生物途徑模擬等。第一部分在純化分離技術上,一般可區分成膠體分離技術SDS-PAGE、等電點聚焦電泳或二維電泳等,和非膠體分離技術-液相層析系統。
二維電泳是最被廣泛使用的方法,通常最多每個細胞可分離出1,000~3,000個蛋白質。另一方面,液相層析結合線上二次質譜儀系統,先以酵素使細胞中所有的蛋白質水解,再分析已水解的蛋白質片段,可解決二維電泳中的問題。
然而,這二項技術雖可分離高濃度的蛋白質,如持家性(house-keeping)和結構性蛋白質,但低濃度的蛋白質通常會被掩蔽而無法鑑定。因此,為分離更多的蛋白質與了解它們的生物功能性,在二維電泳或液相層析的分離系統之前可先進行粗劃分。例如在次細胞蛋白質體中胞器純化就是必須的分離步驟,為的是了解細胞內胞器蛋白質的分布與生物功能。
第二部分是蛋白質質譜儀技術。目前的質譜儀技術主要包含電灑-離子化法、基質輔助雷射脫附/離子化-飛行時間法及液相層析-四極棒法等。
藉由質譜儀的數據可得到胜?質量指紋圖。以胰蛋白?或其他蛋白質水解酵素得到蛋白質水解產物-胜?,再用基質輔助雷射脫附/離子化-飛行時間質譜儀得到質量質譜圖,並比對儀器所附軟體資料庫的理論值與網路上蛋白質序列資料庫,便可鑑定出蛋白質身分。另外,使上述所得胜?進行分子碰撞,可得到蛋白質的胺基酸序列。或由電灑離子化-四極棒/飛行時間法,即磁場型質量分析的二次質譜法,也可得到蛋白質的胺基酸序列。
第三部分是蛋白質資料庫。在後基因體時代,蛋白質分析鑑定工作不再遙不可及,主要原因是自DNA定序結果所推演建立的大量蛋白質序列資料庫可供查詢比對。例如進行人類、大腸桿菌或酵母菌的研究時,這些生物的DNA已完整定序,且得到相對應的蛋白質序列。這時相關的蛋白質身分鑑定僅需進行序列比對工作,而不用逐一地進行蛋白質定序實驗。網路資料庫中有許多參數可供使用,包含蛋白質的分子量、等電點、電荷數、胺基酸組成、胜?片段分子量資料、N端或C端的標籤序列等。
鑑定水產品來源物種
搜尋硬骨魚類的相關蛋白質序列資料庫可找到約23,000條胺基酸序列,相對地核?酸序列卻可找到約610,000條。由此可知在硬骨魚類已知的核?酸序列中,相對應的蛋白質序列僅有約4%被了解。直至目前,以蛋白質體鑑定水產品來源物種或相關功能性蛋白質,仍是水產學界努力的目標。
目前最常做為魚種鑑定的蛋白質標誌,是輕鏈肌凝蛋白和魚類主要過敏原,它們都是小分子量的蛋白質,在不同魚種中有多種次組成,且不易被魚類加工過程如酸、鹼水洗、加熱或乾燥等所破壞。因此,這二類蛋白質可用來鑑定魚類和其相關製品。
在國外,以蛋白質體學技術分析parvalbumin的次組成,被成功應用在親緣接近的鱈魚魚種鑑定上,而且也找到相對應魚種的parvalbumin的胺基酸序列差異性。在國內,親緣及外觀相當近似的有毒河魨魚種,也可輕易地以蛋白質體技術加以辨別。除了魚種鑑定外,蛋白質體學技術在水產品上的應用,主要有鮮度指標鑑定、死後肌肉的生化變化、加工處理的影響等。
近幾年來,蛋白質體學已應用到廣義生物學所涵蓋的各研究領域,並有卓越的貢獻,尤其在生物醫學上,例如蛋白質交互作用、胞器蛋白質體、癌症相關醫療、中草藥研發、單株抗體應用等。蛋白質體也已應用在水產品的安全性、來源鑑定、營養價值評估、鮮度指標、加工影響等研究上。
未來在水產界的蛋白質體學研究,尚有很大的發展空間,例如:高營養價值的水產蛋白質的功能性探討,以及對人體健康的完整評估;建立簡易快速的水產品鑑定技術,做為標準的檢驗操作程序;尋找水產品鮮度指標,或死後生化變化具代表意義的蛋白質標誌,以延長水產品的保鮮期限;水產品食用安全性,包含水產品病原菌、過敏性蛋白質,或其他因不當加工、流通程序所引起的潛在危險因子;環境荷爾蒙等相關因子對水產生物的危害。