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有毒的海洋生物:以蛋白質體辨別有毒魚種

96/12/06 瀏覽次數 19062
市場上販售的魚介類常常未標明種別,倘若販售的是有毒魚介類,則後果堪慮。市場上販售的魚介類常常未標明種別,倘若販售的是有毒魚介類,則後果堪慮。
 
每年歲末年初是大家忙著採買年貨的時節,其中南北雜貨,如魷魚絲、香魚片、蜜餞等是民眾爭相購買的應景食品。但是這些年貨大都是散裝或簡易包裝,並沒有食品衛生單位要求的法定標示,不知消費者是否注意到食用的安全性?沒有標示的食品,會令人擔憂是否貨真價實?是否有違法或過量的食品添加物,例如防腐劑、色素等?是否有不當的加工、流通過程?

由於市場上販售的魚介類多數未標明種別,而且加工後的產品也無法從外觀判斷其原料種別。倘若販售的是有毒魚介類,又不幸被消費者食用,則後果堪慮。

有報告指出,在墨爾本以每公斤15美元販售的鯛魚,其實只是每公斤4至6美元的廉價魚種。在佛羅里達州也有類似的情況,81件標示是紅鯛魚的魚片檢體,僅有30%被鑑定是真品。至於國內,在市售香魚片的毒性調查中,發現有11.9%的產品含有輕微河魨毒性,衍生出消費者食用安全的疑慮。河魨是日本人相當喜愛的食品,而河魨毒卻是一大困擾,因此河魨料理師傅需要通過嚴謹的廚師證照考試。但在臺灣這一制度尚未周全,因此近年來曾爆發數起河魨毒中毒案例,也導致國人喪失寶貴的生命。

為杜絕業者摻假謀取不法利益,造成食用安全的顧慮,水產品的來源物種鑑定實是刻不容緩。如何有效區分有毒和無毒的河魨種類及加工產品,顯得日趨重要。以基因法或蛋白質鑑定法都能有效判定魚種,本文說明十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和等電點聚焦電泳法(isoelectric focusing electrophoresis, IEF)的理論和操作方法,並介紹在後基因體時代的關鍵技術以及在魚種鑑定上的應用。

SDS-PAGE法

基礎理論 電泳是一種提供外加電場來分離帶電粒子,依粒子大小、電荷數、形狀等不同而有不同分離程度的技術。SDS-PAGE的原理是加入一種陰離子變性劑十二烷基硫酸鈉SDS,它會與大部分蛋白質產生疏水性作用,並以一定比例與蛋白質結合,使這些蛋白質失去本身的電荷,同時形成一形狀穩定且帶負電荷的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺蛋白質聚合物。因此在SDS-PAGE中,蛋白質的移動速率僅與本身分子量的大小有關,可據以判斷蛋白質的純度及其組成次單元的分子量。
 
臺灣產主要有毒和無毒河魨(左),蛋白質體學流程圖(右)。臺灣產主要有毒和無毒河魨(左),蛋白質體學流程圖(右)。
 
操作流程 主要分3個部分,分別是蛋白質的抽取、電泳的分析和膠片的染色。首先取魚肉溶於適當體積的水中,經均質化、離心及過濾後,其上層液就是水溶性蛋白質。把樣品與樣品緩衝液混合加熱後,取適當體積注入樣品槽中,提供一外加電場,在固定電壓或電流下開始泳動。電泳後把膠片取出以考馬斯藍或銀染色,再去掉染劑,最後以目視法或用密度分析儀計算並分析其分子量組成。

IEF法

基礎理論 主要以樣品本身所帶的電荷來分離物質,與分子量大小無關,這個特性與SDS-PAGE不同。蛋白質是兩性物質,當淨電荷是零時,就是等電點。若外在環境酸鹼值(pH)與蛋白質的等電點相同時,蛋白質會停止泳動,因此可利用pH梯度來達到分離不同等電點蛋白質的目的。

操作流程 與SDS-PAGE相似,把低分子量的有機酸和鹼或電解質加入膠片配製液,使其成膠後經預對焦,即加入一外加電場,使膠片中的pH成梯度分布狀態,再把蛋白質注入這系統中。在外加電場驅動下,每個次單元蛋白質會停在一固定的pH點上,這時的pH就是蛋白質本身的等電點。隨著膠片上pH梯度不同,不同等電點的蛋白質會分布在膠片上不同位置,而達到分離的目的。

比較上述二種方法,IEF較SDS-PAGE有更佳的解析度,但操作繁雜,費用也較高,SDS-PAGE是最簡單常用的分析方法,且費用最低。

蛋白質體

蛋白質體(proteome)的觀念首度於1994年在二維電泳會議中提出,並在1995年闡述於學術期刊論文中。其後蛋白質體便成為各學術會議的熱門主題,每年有數百篇論文在著名期刊中發表。截至目前,美國國家醫學圖書館期刊文獻檢索系統(PubMed)中有關蛋白質體學的文章已近萬篇,包含回顧文章二千餘篇。

蛋白質體意指個體內所有被基因體(genome)表達的蛋白質,包括特定的細胞、組織、臟器等的基因經轉錄及轉譯產生的全部蛋白質。蛋白質體會受成長分化、外在環境、疾病、老化等影響而變化,因此蛋白質體學是以廣泛的角度,觀察生物體面臨生理轉變或疾病反應時,整體蛋白質定性和定量的變化,以及蛋白質間交互作用等表現情形,並非針對單一蛋白質進行研究,而是探討整個蛋白質體內蛋白質的所有變化。

蛋白質體學在生物學上的應用,最常使用的是找出具有「質」與「量」改變的蛋白質。許多疾病的產生並非單純是某一種蛋白質失調所造成的,而是整個蛋白質網絡發生改變所造成的。近幾年來,已逐漸建立很多單一細胞或組織的蛋白質體資料庫。

蛋白質體學的技術涵蓋很多層面,大抵上包含3大部分,即純化分離技術、生物質譜儀技術,以及後續電腦程式的蛋白質資料庫和生物途徑模擬等。第一部分在純化分離技術上,一般可區分成膠體分離技術SDS-PAGE、等電點聚焦電泳或二維電泳等,和非膠體分離技術-液相層析系統。

二維電泳是最被廣泛使用的方法,通常最多每個細胞可分離出1,000~3,000個蛋白質。另一方面,液相層析結合線上二次質譜儀系統,先以酵素使細胞中所有的蛋白質水解,再分析已水解的蛋白質片段,可解決二維電泳中的問題。

然而,這二項技術雖可分離高濃度的蛋白質,如持家性(house-keeping)和結構性蛋白質,但低濃度的蛋白質通常會被掩蔽而無法鑑定。因此,為分離更多的蛋白質與了解它們的生物功能性,在二維電泳或液相層析的分離系統之前可先進行粗劃分。例如在次細胞蛋白質體中胞器純化就是必須的分離步驟,為的是了解細胞內胞器蛋白質的分布與生物功能。

第二部分是蛋白質質譜儀技術。目前的質譜儀技術主要包含電灑-離子化法、基質輔助雷射脫附/離子化-飛行時間法及液相層析-四極棒法等。

藉由質譜儀的數據可得到胜肽質量指紋圖。以胰蛋白酶或其他蛋白質水解酵素得到蛋白質水解產物-胜肽,再用基質輔助雷射脫附/離子化-飛行時間質譜儀得到質量質譜圖,並比對儀器所附軟體資料庫的理論值與網路上蛋白質序列資料庫,便可鑑定出蛋白質身分。另外,使上述所得胜肽進行分子碰撞,可得到蛋白質的胺基酸序列。或由電灑離子化-四極棒/飛行時間法,即磁場型質量分析的二次質譜法,也可得到蛋白質的胺基酸序列。

第三部分是蛋白質資料庫。在後基因體時代,蛋白質分析鑑定工作不再遙不可及,主要原因是自DNA定序結果所推演建立的大量蛋白質序列資料庫可供查詢比對。例如進行人類、大腸桿菌或酵母菌的研究時,這些生物的DNA已完整定序,且得到相對應的蛋白質序列。這時相關的蛋白質身分鑑定僅需進行序列比對工作,而不用逐一地進行蛋白質定序實驗。網路資料庫中有許多參數可供使用,包含蛋白質的分子量、等電點、電荷數、胺基酸組成、胜肽片段分子量資料、N端或C端的標籤序列等。

鑑定水產品來源物種

搜尋硬骨魚類的相關蛋白質序列資料庫可找到約23,000條胺基酸序列,相對地核苷酸序列卻可找到約610,000條。由此可知在硬骨魚類已知的核苷酸序列中,相對應的蛋白質序列僅有約4%被了解。直至目前,以蛋白質體鑑定水產品來源物種或相關功能性蛋白質,仍是水產學界努力的目標。
 
水產品來源物種的鑑定可杜絕摻假,也可免除食用安全上的顧慮。水產品來源物種的鑑定可杜絕摻假,也可免除食用安全上的顧慮。
 
目前最常做為魚種鑑定的蛋白質標誌,是輕鏈肌凝蛋白和魚類主要過敏原,它們都是小分子量的蛋白質,在不同魚種中有多種次組成,且不易被魚類加工過程如酸、鹼水洗、加熱或乾燥等所破壞。因此,這二類蛋白質可用來鑑定魚類和其相關製品。

在國外,以蛋白質體學技術分析parvalbumin的次組成,被成功應用在親緣接近的鱈魚魚種鑑定上,而且也找到相對應魚種的parvalbumin的胺基酸序列差異性。在國內,親緣及外觀相當近似的有毒河魨魚種,也可輕易地以蛋白質體技術加以辨別。除了魚種鑑定外,蛋白質體學技術在水產品上的應用,主要有鮮度指標鑑定、死後肌肉的生化變化、加工處理的影響等。
 
市面上販售的香魚片製品須留下尾鰭部分以做為初步判別的依據市面上販售的香魚片製品須留下尾鰭部分以做為初步判別的依據
 
近幾年來,蛋白質體學已應用到廣義生物學所涵蓋的各研究領域,並有卓越的貢獻,尤其在生物醫學上,例如蛋白質交互作用、胞器蛋白質體、癌症相關醫療、中草藥研發、單株抗體應用等。蛋白質體也已應用在水產品的安全性、來源鑑定、營養價值評估、鮮度指標、加工影響等研究上。

未來在水產界的蛋白質體學研究,尚有很大的發展空間,例如:高營養價值的水產蛋白質的功能性探討,以及對人體健康的完整評估;建立簡易快速的水產品鑑定技術,做為標準的檢驗操作程序;尋找水產品鮮度指標,或死後生化變化具代表意義的蛋白質標誌,以延長水產品的保鮮期限;水產品食用安全性,包含水產品病原菌、過敏性蛋白質,或其他因不當加工、流通程序所引起的潛在危險因子;環境荷爾蒙等相關因子對水產生物的危害。
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