2014年諾貝爾化學獎
104/05/06
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簡汎清｜
中央大學光電科學與工程學系
陳培菱｜
中央研究院應用科學研究中心副研究員
2014年的諾貝爾化學獎由美國霍華德修斯醫學研究所的貝齊格（Robert Eric Betzig）教授、史丹福大學的莫納（William E. Moerner）教授和德國馬克斯普郎克研究所的赫爾（Stefan W. Hell）教授共同獲得，他們的主要貢獻在於超解析度螢光顯微術的開發。3位教授帶領的研究團隊運用不同的原理分別發展出超解析度螢光顯微術，解決了一百多年來困擾科學家在使用光學顯微鏡時，因光學繞射極限而無法清楚看到奈米尺度影像的問題。
利用超解析度螢光顯微術，科學家已可清楚觀察到單一蛋白質分子在活細胞中的行為，並為治療神經退化疾病如帕金森氏症、阿茲海默氏症、杭亭頓氏症等疾病帶來一線曙光。
光學繞射極限
人類善於觀察周遭事物，並歸納觀察結果總結出萬物運行的道理，累積而成文明。觀察最主要靠眼睛，人類眼睛可觀察到的物體最小尺度約為一百微米，也就是一根頭髮的寬度。如果要看到更小的物體，往往需要借助放大鏡或顯微鏡等工具放大物體的影像。
在13世紀時的義大利，人們藉由研磨後的鏡片來改善視力。在17世紀初，科學家已經知道利用透鏡組放大微小的物體（顯微鏡）或天體（望遠鏡）。虎克利用顯微鏡觀察軟木塞樣品時，把觀察到的結構影像命名為「細胞」，為現代生命科學奠定基礎。利用光學顯微鏡觀察微觀世界的好處是，可以親眼看到微觀世界的事物，然而顯微鏡無法無限制地放大微小物體的影像。
1873年阿貝（Ernst Abbe）基於光的波動性，根據光波繞射理論分析出，光學顯微鏡的最高解析度約為光線波長的一半。也就是當微小結構間的距離小於光線波長的一半時，便無法藉由光學顯微鏡來分辨，在這個尺度以下，觀察到的影像是模糊的。人類眼睛可看到的可見光波長約為400至800奈米，也就是說，肉眼藉由光學顯微鏡可分辨的最小結構約為200奈米。
為了獲得更高解析度的影像，在過去的一百多年裡，科學家嘗試各種辦法來克服光學的繞射極限，但都無法突破。一直到二十多年前由於各式光譜學的快速發展，啟發了科學家新的想法。
單分子顯微術
一般而言，化學物質的基本單位是分子，它的大小是奈米等級，因此無法直接觀測單一個分子的行為。為了量測分子的性質，科學家利用光譜學來決定分子的結構。起初光譜的量測需要一次測量非常多數目的分子來獲得足夠的訊號。到了1989年，在加州IBM研究中心的莫納教授在液態氦溫度下，第一次觀測到在三聯苯（p-terphenyl）晶體中單一的並五苯（pentacene）分子的吸收光譜，開啟了單分子光譜的研究。
這使得科學家對分子的研究不再受限於整體性或平均性的數據觀測，而能進一步量測樣品中每一個分子的性質差異，得到更深入的分子差異性分析與資訊。
當可以測量單一分子的光譜時，科學家同時理解到獲得單一分子的影像不再是夢想。為了提高單分子光譜的訊噪比，紛紛提出各式的光學量測技術。其中於1993年在貝爾實驗室的貝齊格利用近場探針掃描螢光樣品，在非常靠近樣品表面的距離擷取單分子螢光的近場光學訊號，藉由近場量測方式突破光波遠場繞射極限的問題，首度獲得超解析度的螢光影像。
由於光學繞射極限是遠場的效應，當偵測器非常靠近光源時（近場），光學繞射極限並不適用，因此可以獲得較高解析度的影像。然而受限於近場的量測，偵測器到樣品的距離須小於波長，因此無法用於觀測較厚的樣品或獲得三維影像。因為無法突破樣品的限制以及家庭因素，貝齊格於1995年決定離開學術界，即使如此，他仍醉心於如何突破繞射極限。
在離開學術界前的某個冬天，他在散步時突然想到，如果螢光分子可以在不同的波長發光，或許可以克服繞射極限，因為繞射極限是針對單一波長的光源。
他認為如果可以把同一顏色的螢光分子放在遠超過光學繞射極限的距離，就可以很準確地決定每一個分子的中心位置。如果樣品裡有很多不同顏色的螢光分子，就可以分別決定每一種顏色分子的位置。這時再把不同顏色分子的位置重疊在同一張影像上時，就可以獲得解析度高於繞射極限的影像。但是當時這種分子並不存在；隨後，他在《光學通訊》上發表了一篇理論文章後便在學術界銷聲匿跡一段時間。
莫納教授在1997年進入加州大學聖地牙哥分校執教，並進行綠螢光蛋白突變種的研究，他發現可利用特定波長的雷射光，使這種突變種的綠螢光蛋白在螢光活化態和非活化態間轉換。也就是說，利用雷射可控制綠螢光蛋白是否發光。在90年末期至2000年初期，單分子光譜大量運用在研究生物系統上，加上螢光蛋白質的快速開發（2008年諾貝爾化學獎），科學家對分子生物學有更深一層的認識，例如單一蛋白質在奈米尺度的運動方式及距離，然而繞射極限的問題始終未獲解決。
直到2005年的某一天，貝齊格在一個偶然的機會，看到了學界新發展出的各式螢光蛋白質有莫納教授在1997年發現的特性，並可利用雷射隨意控制螢光蛋白質的活化及顏色變化。貝齊格了解到這就是他夢寐以求的螢光分子，於是他和友人集資建構了一臺新型的顯微鏡，並與專門開發螢光蛋白質的實驗室合作進行實驗。
他們把螢光分子表現在細胞中的溶小體，並用微弱的雷射活化螢光蛋白使其發光。他們發現，被活化的螢光蛋白數量非常少，螢光蛋白間的距離遠大於繞射極限的距離，因此可以精確地決定每一個螢光蛋白的位置。等到螢光蛋白因照光過久失去活性而不發光後，他們再重新活化其他螢光蛋白並決定它們的位置。
利用這方法並不需要螢光分子發不同波長的光線，因為螢光分子在被觀察一陣子後會光致退色而不再發光。如此，周而復始，直到所有的螢光蛋白被活化，他們也獲得所有螢光蛋白的位置，並把所有螢光蛋白的位置疊加形成溶小體的超解析影像。
這方法是把單一螢光分子視為一個點光源，進而以高斯函數近似定出中心點的位置。當偵測到的光子數量越多，定位的標準差就越小，當光子數增加後，對單一螢光分子的空間定位精確度就可達到遠小於繞射極限的尺度。因為一次只決定一個點光源的位置，其他的螢光光源遠在繞射極限的距離外，不會互相干擾，所以定位精確度是由偵測到的光子數量來決定，而非繞射極限。利用這方法就能成功地克服繞射極限的限制，重建出超解析度螢光分子影像。
2006年貝齊格的研究團隊把研究成果發表在著名學術期刊《科學》上，當時每一幅超解析度影像需要2至12小時來擷取實驗數據，也就是這些影像是利用時間上的堆疊來換取空間上的解析度。隨著高速高靈敏度的電子增益式電子耦合偵測器的成熟發展，以及電腦計算能力的增加，目前這方法已可在幾秒內獲得超解析度的影像。
這種系統在設計上十分簡單，只需把雷射耦合進一般光學顯微鏡即可，因此能廣泛地在學術界採用。例如中研院的研究團隊於2007年底成功地搭建完成超解析度顯微鏡，並在陽明大學林崇智教授的幫助下獲得粒線體的超解析度影像。目前，學界已可利用這項技術獲取活細胞的三維影像，其精確度高於10奈米。
受激發射損耗顯微術
所謂條條道路通羅馬，莫納與貝齊格發展出的超解析度顯微術是利用單分子技術，德國的赫爾教授則是用受激發射損耗顯微術（stimulated emission depletion（STED）microscopy）來獲得超解析度影像。
自從赫爾於1990年在海德堡大學獲得博士學位後，他一直夢想要突破繞射極限的限制，然而德國資深的教授們並不看好他可以成功。於是赫爾前往芬蘭圖爾庫（Turku）大學從事博士後研究，致力於螢光顯微術的開發。當他讀到受激發射（stimulated emission）的相關論文時，他了解可以利用受激發射原理製造出奈米手電筒，來獲得超越繞射極限限制的超解析度影像。
受激發射是由愛因斯坦所提出，當原子或分子吸收能量後，電子會躍遷到激發態，在激發態的電子會在一定的時間內（lifetime，生命期）釋放能量回到基態。在激發態的電子回到基態前，如果有另一道能量與受激電子能量相同的入射光，就能迫使激發態電子直接回到基態，並發出與入射光方向、波長及相位相同的光線，這受激發射是雷射產生的主要原理。
赫爾當時認為，如果先用一道光產生繞射極限大小的光點來激發螢光分子，再用另一道甜甜圈形狀的光點重疊在原繞射極限的光點上，則位在甜甜圈形狀的光點上的螢光分子會先被第一道光激發到激發態，並被第二道光打回基態，其結果就是只有甜甜圈內的螢光分子會發螢光而被觀察到。
在甜甜圈上的螢光分子所發的光因為波長與第二道光相同，可以用濾鏡濾掉而不被偵測到。這就好像用一隻奈米等級的手電筒照射螢光分子，只會看到手電筒（甜甜圈內）照到區域的螢光分子，外圍螢光分子發的光會被第二道光利用受激發射原理關掉。
赫爾在1994年發表這種突破繞射極限的STED原理與實驗方法的論文，但未獲重視。一直等到他回到德國馬克斯普朗克生物物理化學研究所任職後，才把他的想法進一步付諸實行，建立了一台STED顯微鏡，並在2000年發表突破繞射極限的超解析度影像。
利用這激發光和受激發射損耗光照射螢光樣品時，在繞射極限區域外緣的螢光都因受激發射而損耗，只有繞射極限中心區域可發出螢光訊號。由於這中心區域會隨著受激發射損耗光的強度增加而縮小，因此可利用增加受激發射損耗光強度使發出螢光訊號區域縮小，達到遠小於繞射極限的尺度。再以這種激發方式掃描樣品後，就可得出超解析度螢光光學顯微影像。
利用STED方式獲得超解析度影像的好處是速度快，因為它的光學設計與共軛焦顯微鏡相似，可以搭配共軛焦顯微鏡快速掃描樣品。如果把第二道光源關閉，得到的影像就是一般的共軛焦影像，非常適合用於觀察活細胞系統。然而，利用這種方法獲得影像的解析度與第二道雷射的能量有關，要獲得高解析度影像常需要很高的能量而造成樣品的損傷。近來，利用連續波做為第二道雷射以及使用時序門控（time gated）的偵測方式，可大幅降低所需的雷射能量並減少樣品的損傷。
阿貝在1873年提出繞射極限，一百多年來，許多科學家認為無法超越這光學物理瓶頸。然而由於2014年3位諾貝爾化學獎得主卓越的研究成果，發展出新穎的超解析度螢光顯微術，得以突破這項限制。螢光影像的解析度達到遠小於繞射極限，使科學家可以清楚地觀測到小分子表現，開啟螢光影像分析的新紀元，目前已廣泛應用於各項生物醫學研究領域，未來更會加速生物技術研究的進展。
