奈米科技與DNA感應器
91/11/26
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隋安莉｜
嘉南藥理科技大學醫務管理系
近年來，由於生物科技的進步，不斷地研發出許多新型生物檢測方法，其中用來檢驗特定基因中去氧核醣核酸（DNA）序列的技術更是蓬勃發展。
所謂基因就是一段特定序列的DNA，以去氧核醣與磷酸酯為主要骨幹，並含有四種鹼基：腺嘌呤（A）、鳥糞嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）與胞嘧啶（C）。在兩條單股DNA之間，由於化學結構的相互吻合，可藉由A與T，G與C之間形成特定的氫鍵而相互吸引，構成雙股螺旋狀的DNA構造。
科學家可由一股已知的DNA鹼基序列，推測出互補的另一股DNA鹼基序列。例如，一條DNA序列為AATTCGC，則其互補序列就是TTAAGCG。當二者序列完全吻合時，其間氫鍵吸引的力量最強；相對的，即使只有一個鹼基無法配對，就會使結合力減弱，在此種狀況下可以藉由增高溫度或是改變其所處溶液中的離子濃度，使錯誤配對的DNA序列脫離。
在長鏈DNA骨架中，以每三個鹼基為一密碼組，一個密碼組隱藏著一個特定胺基酸的信息。特定的基因在細胞核內先轉錄成信使核醣核酸（mRNA），mRNA即可攜帶錄自DNA的訊息經由核膜上的核孔到達細胞質，利用細胞質中的核醣體轉譯合成出特定的蛋白質，進而執行其在細胞中的生理功能而完成該基因的指令。有時即使僅有一個鹼基異於正常的基因序列，都有可能造成嚴重的生理缺陷。某些遺傳疾病，可藉由DNA的檢驗早期發現，及時治療。
科學家往往藉著此種DNA互補配對的特性，應用於基因檢測上。簡而言之，可先利用DNA合成儀製造一些特定的單股DNA序列，再藉由其互補配對的特性就能「抓住」欲檢測樣品中可與其配對的DNA序列。本文中介紹美國西北大學化學系莫金（Chad Mirkin）教授所領導的研究團隊所發展的三種以奈米科技為基礎的DNA檢測方法，這些方法首次將奈米科技與DNA序列結合應用於感應器上，其敏感度與選擇性均有重大突破。
奈米的特性
所謂奈米是一種長度的單位，而且是極為微小的一種單位。1奈米為10—9公尺，大約是10個氫原子的併排寬度，這可能還是無法提供具體的奈米概念。若以人類身體構造為例，頭髮的平均直徑大約在350微米左右，也就是說約有350,000奈米，紅血球的直徑約為7,500奈米。
當物質以奈米級的大小存在時，不僅是體積的縮小，其導電性、磁性、電阻性、光學、物理及化學性質也會有很大的改變。舉例來說，這種DNA感應器所利用的材料是金（Au）奈米粒子。在一般人的認知中，黃金是黃色並帶有金屬色澤。但是，當它以奈米大小的粒子形式存在時，光學性質會因體積的極度縮小而有所改變，隨著粒徑的逐漸縮小，顏色的變化依序為黃、橘（約100奈米）、綠（約50奈米）、暗紅（約13奈米）。不但如此，當奈米粒子的直徑、形狀稍作變化時，也會顯現出不同的顏色。
一般而言，圓形的奈米粒子較易製備，而製造三角形與三稜鏡形奈米粒子雖較困難，但均已找出製備的方法。因此，只要操縱顆粒的大小、形狀與種類即可達到不同的呈色結果。
下述三種DNA偵測技術中，都是利用金奈米粒子為材料，第一種是利用DNA抓住奈米粒子而呈色；第二種是以金奈米粒子顏色變化的特性為基礎，增加溫度後即可鑑別不同的DNA序列；第三種則是利用DNA促成奈米粒子整齊排列，進而形成電流通路，而達到偵測DNA的目的。由於這些偵測技術的選擇性極高，即使DNA片段中僅有一個鹼基的差異，亦能分辨得出來，因此應可取代螢光呈色的技術而應用在基因晶片上。
掃描式DNA感應器
莫金教授的研究群發表的掃描式DNA感應器，是以金奈米粒子的呈色為基礎。它的原理是以人工合成兩種不同長度的單股DNA序列，各為12個與15個鹼基，將它們分別固定在玻片與直徑約為13奈米的金奈米粒子上，在金奈米粒子上所連接的DNA序列稱為探針序列，另外在載玻片上的DNA序列稱為捕捉序列。這兩種DNA序列可分別與欲測樣品中具有27個鹼基長度的標的DNA的兩端互補配對，形成類似三明治般的構造。
如同一般的基因晶片，掃描式DNA 感應器是預先在載玻片上將許多不同的DNA序列a、c、d、e等予以固定。其中只有序列a才能與標的DNA序列（ab）的一端形成互補配對。三者混合後，序列ab分別和玻片上序列a與金奈米粒子上的b形成結合。再用緩衝溶液將未配對或多餘的DNA序列清除。若樣品中標的DNA序列的濃度夠高，則會顯出淡淡的粉紅色，再以含有硝酸銀的溶液處理，由於金奈米粒子可促進銀的沈積，便可呈現黑色。
利用此種配對原理，可將金奈米粒子間接地固定在玻片上。當其序列間的鹼基能完全互補配對時，其結合力最強，若無法完全配對時，結合力即減弱，因此可藉著增加溫度，而使得非標的DNA序列脫離。
在經過增溫處理以確定僅存專一性結合後，存在的足量金奈米粒子會使樣品呈現粉紅色（樣品莫耳濃度為10－8、未以銀離子顯影液處理者），但是當樣品中的標的DNA濃度降低時，粉紅色即變淡，無法以肉眼覺察（樣品莫耳濃度為10－10、未以銀離子顯影液處理者）。
為了解決這個問題，研究人員發現可加入含有銀離子的顯影液。因為金奈米粒子可促進銀離子與顯影液中所含還原劑（氫）之間的反應而生成還原態的銀，銀的沉積會顯出黑色，不但容易辨識，而且可用一般傳統的光學掃描儀器偵測。利用所得深淺不同的結果以灰階加以相互比較，就可區別樣品間濃度的高低，甚至能輕易地以肉眼觀察，因此大大提升了敏感度。即使當DNA序列間的差異只有一個鹼基時，都能區分出來。
由此掃描式DNA感應器所檢測的結果顯示，在較低溫時（攝氏40度），除了正確配對的鹼基A之外，其他三種錯誤的G、T、C鹼基對亦可結合。但是當溫度提升至攝氏50度時，僅有正確的腺嘌呤（A）仍然維持配對狀態，其他三種（亦即G、T、C）的呈色會消失，因此決定選擇性的溫度是攝氏50度。若是溫度繼續升高至攝氏60度，即使是含有正確的腺嘌呤（A）的DNA序列也會脫離，而導致呈色完全消失。
以螢光為呈色的方法雖也有類似的結果，但是增溫範圍太小（攝氏15度至35度），決定專一性結合的溫度也較掃描式DNA感應器來得低。因此，溫度的變化只要高於正確結合的溫度攝氏35度，就會導致專一性結合的DNA序列脫離而使得呈色減弱。此外，由於實驗過程中需要反覆地以溶液沖洗，當正確序列結合的溫度太接近室溫時，會使得部分專一性與非專一性結合的DNA序列較容易一起被洗掉，因此其呈色普遍性地較為微弱。
由於掃描式DNA感應器的專一性結合溫度較高，就可以避免這種困擾。其敏感度較一般以螢光劑為呈色的方法高100倍，而且對於單一鹼基錯誤配對的選擇性也高出3倍。同時，因為掃描式DNA感應器的敏感度較高，對於樣品的量要求也就較低，因此優於一般以螢光呈色的DNA感應器。
以掃描式DNA感應器來偵測樣品中的DNA序列時，樣品中的標的DNA序列的濃度高低雖然可藉由灰階來推測，但是其結果僅能以黑白二色呈現，因此每次能檢測的種類數目受到較大的限制。以螢光分子為標幟的偵測法中能有顏色上的變化，較受一般檢驗人員的歡迎，而且若能以彩色呈現，就可以容許在檢驗樣品中一次含有多種待測的DNA序列，因此，如何將黑白變為彩色就變成研究人員的下一個目標。
彩色DNA感應器
簡單地說，彩色DNA感應器的基本原理與掃描式DNA 感應器類似，但其差別為所用的金奈米粒子有兩種不同的直徑。研究人員研發出一種特殊的化學方法，可將與欲探測的兩種DNA序列互補的片段DNA予以修飾後個別連接在不同大小的金奈米粒子上，其粒子直徑分別為50與100奈米。其中一種DNA（a）與100奈米的金奈米粒子連結，另外僅有一個鹼基差異的相似DNA（b）則與50奈米的金奈米粒子連結。在玻片上事先固定有單股DNA序列（c,d），當此種帶有特殊序列的DNA-金奈米粒子，藉由標的DNA（ac, bd）分別與玻片上的單股DNA序列結合後，再以光照射，50奈米的金奈米粒子呈現綠色，而100奈米的金奈米粒子則呈現橘色。
利用此方法，可偵測兩種不同的DNA序列。在較低溫度下（攝氏45～55度），二者均可與玻片上的DNA配對而呈色，但是將溫度升高至攝氏60度後，有差異的DNA片段就會因為其中唯一的一個相異的鹼基無法配對而結合力減弱，導致脫離，所顯現的綠色也因而消失。
在檢測的過程中，隨著溫度的升高，顏色隨之變化，進而綠色消失，以肉眼即可觀察到。由此結果即可判斷，能夠與直徑為100奈米的金奈米粒子配對的標的DNA與50奈米的金奈米粒子配對的另一種標的DNA含有不同的序列。
這種方法目前雖只能比較兩種樣品，但是未來仍有改善的空間。可藉著改變金奈米粒子直徑的大小或形狀的差異，產生不同的顏色而增加測試種類的數目。由於其專一性極高，不但可應用在一般的基因檢驗上，亦可用來偵測基因的單一核酸多型性（single-nucleotide polymorphism，SNP）差異與基因突變所導致的疾病。所謂單一核酸多型性差異是指某些基因在同種但不同的生物個體之間，其DNA序列僅只有一個核酸不同，雖然差異極小，但視其基因的重要性仍會造成明顯的個體差異。例如，可能會對某些疾病特別有抵抗性或是特別易受感染。
電子式DNA感應器
這個研究團隊又研發出另一種更靈敏的DNA感應器。他們在鍍有一層氧化矽的矽版上，以光蝕刻法製造出來一種微小電極，在電極間有一極細小的溝。在此溝中先固定一特定的DNA序列（a），再將電極浸入一種含有標的DNA序列（ab）與帶有另一特定序列（b）的金奈米粒子的溶液中。此標的DNA序列的兩端可分別與電極溝中的與金奈米粒子上的DNA序列配對結合，因此可將金奈米粒子固定在電極溝之間並形成緊密排列，再以含硝酸銀的顯影液加以處理。
因為金奈米粒子可促進銀的還原反應，而使得銀沈積在上面，浸在顯影液中的時間愈久，所沈積的銀粒就愈多，電子便可在兩極間形成通路而產生傳導，其電極間的電阻即大幅降低。因此測量電阻即可偵測出是否有DNA序列的配對結合。
由於非標的DNA序列與電極間序列無法完全配對，二者間的結合力較弱，因此使用含有特定濃度鹽類（10毫莫耳濃度的鈉離子溶液）的溶液予以浸洗後，即可將電極間錯誤配對的標的DNA序列洗去。另外，也可以用上述彩色DNA感應器中增加溫度的方法來去除錯誤配對的DNA序列。所以可視當時偵測環境的限制，利用這兩種簡便的方法（溶液沖洗或改變溫度）中任意一種，來達到區分正確的互補配對DNA序列的目的。
研究人員並發現此方法所要求的樣品量可低至5 × 10－13莫耳濃度，這是一般以螢光分子為標幟的DNA偵測法所要求的樣品量的十分之一，而對於單一鹼基差異的選擇性更高達十萬倍。
從上述的各種檢驗方法中，我們看到科學家們針對各種問題不斷地加以解決、改進，巧妙地結合不同的科學領域，創造出更精密、更方便、也更快速的DNA感應器。在這些研究中，結合了有機化學、無機化學、材料科學與生物化學等多方面的知識，形成團隊，創造了更出色的研究成果。
這些DNA感應器可應用在各式生物檢測中，如細菌、病毒的感染、基因突變、遺傳篩檢，也可在戰爭中檢驗生物戰劑。例如，在這三種DNA感應器中，科學家們所設計使用的含有27個鹼基的標的DNA，就是九一一事件後名噪一時的炭疽菌所分泌的一種致命因子的基因片段。
除了上述這些檢測外，未來也用於基因缺陷的快速檢測，甚至能藉著檢測的數據提供我們許多到目前尚屬未知的解答，例如，核酸多型性差異與各種疾病、併發症間的關係，進而研發出診斷與預防的方法。人類因為有了這些成果，方能在醫療上大步邁進，期待有朝一日能達到「一切疾病，預防重於治療」的最佳境地。
