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組合化學在醫藥開發上的應用

91/09/05 4597

謝銘隆｜中正大學化學暨生物化學研究所

吳天鳴｜中正大學化學暨生物化學研究所

王宜君｜中正大學化學暨生物化學研究所

朱延和｜中正大學化學暨生物化學研究所

每當我們身體不適就醫時，醫生總會依不同的病情開立藥方來治療。好奇的你是否曾經想過，為什麼得這種病要吃這種藥？得另一種病就得吃另一種藥？哪一種藥物對於疾病的治療才是最正確、最適合的呢？當初這些藥物又是如何開發出來治療特定的疾病呢？

目前在市面上合法販售的藥物巳逾萬種，卻只能治療五百種與人類相關的疾病，還不到目前人類基因疾病種類的百分之一，也就是說在藥物的開發上，仍然有很漫長的路要走。另一方面，長期藥物濫用所造成的自然反撲，導致疾病的治療更加棘手，所以醫學技術的增進及新藥開發的需求，也因此更加迫切。

傳統的藥物研發過程可以說是相當地漫長且繁瑣，最初新藥的試驗品可以是細菌和動、植物等自然界的化學物質，或是各種的合成化合物，再從這些數目龐大的化合物中選取、測試出具有生物活性價值的化合物。一般而言，從十萬個化合物中約可以篩選出一個先導化合物，而每50個先導化合物中會有一個通過必要的生物活性測試並進行臨床實驗，最後在20個進入臨床實驗的候選藥物中，只有一個新的藥物誕生。再者，根據統計，一種新藥的開發過程，平均需要13年的時間，及超過三億美元以上的經費，不但十分耗時、成本昂貴，而且必須投入相當多的專業研究人力。

因此，為了能夠快速研發出新的藥物，科學家必須設法在短時間內更有效率地合成、修飾、篩選出大量的化合物，以縮短新藥商品上市的時間。也就是說，在今日新藥開發高度競爭的環境中，研發人員必須能夠很快地製造出數百萬結構相似、且具多樣性的化合物分子，並完成篩選的工作，而「組合化學」（Combinatorial Chemistry）正好能符合這樣的需求。

組合化學的概念與源起

組合化學可以定義為：由有機、無機的構築分子，以所有可能的排列組合方式來進行化學合成反應，藉此快速地得到數目龐大且具多樣性的的產物–分子庫（library）。換句話說，化學家利用簡單的組合概念來製備可以提供篩選的分子庫。

首先，研究人員選出一組構築分子組塊，藉由化學反應組合出結構複雜且多變化的化合物。舉例來說，有A及B兩類構築分子組塊，其中又分為有結構相似的A1、A2及B1、B2類分子，假設A及B這兩類分子可以發生化學反應產生新分子，如此，利用排列組合的概念，便有二乘二得到四的組合數目：A1-B1、A1-B2、A2-B1、A2-B2。依此類推，使用的構築分子數目增加，組合的數目就會快速地攀升。此與先前傳統開發新藥的方法相比，組合化學可以快速地提供臨床測試用的藥物，且花費的人力、物力也將減少很多。

就組合化學整體的發展過程來說，其技術開發最初是建立在固相合成上，並且首先應用於胜肽（peptide）的合成。胜肽及蛋白質（protein）都是各種胺基酸（amino acid）經由縮合反應作用而形成的化合物，種類極多，並在生物體內扮演相當重要的角色。然而大部分胜肽及機能性蛋白質在生物體內的含量都不高，要取得一定的量來從事研究十分困難，因此，利用化學合成方法得到所需要的胜肽及蛋白質，以進行功能及結構上的研究，就顯得非常重要。

1902年的諾貝爾化學獎得主費雪（Emil H. Fischer）首先利用化學方法合成出一段簡單的胜肽。約半世紀後，催產素及血管加壓素等具有生物活性的胜肽也一一合成了出來。由於這些胜肽合成反應都還侷限在溶液相中進行，所以實驗操作極為繁瑣費時，而且得到的產率也很低。

1959年，美國紐約洛克斐勒大學的梅里菲爾德（Robert B. Merrifield）提出了新的構想：若利用共價鍵結合的方式，將所要合成的胜肽連接在固體小珠粒上，這樣就可以只用簡單的過濾方式來沖洗去除過剩的反應物及副產物，而不需要額外進行分離純化的操作，而且合成出來的胜肽在清洗純化的過程中不會有所損失，如此更可以達到自動化合成的目標，稱為「固相胜肽合成法」。至於反應所需的固體小珠粒材料，則由聚苯乙烯加以化學修飾，使其末端帶有氯甲基，以便和第一個胺基酸的羧基發生反應而形成共價鍵結，藉此固著在小珠粒上。一旦胜肽的合成反應結束，可以藉氫氟酸將整段合成的胜肽從聚苯乙烯的小珠粒直接切下而獲得產物。這樣的珠子稱為「梅里菲爾德樹脂」（Merrifield resin）。梅里菲爾德本人也因此在1984年榮獲諾貝爾化學獎桂冠。

組合化學最初的構想是在1984年由蓋爾森（Mario H. Geysen）及其工作同仁提出。他們利用上述之固相合成法，以排列組合的方式，合成出由各種胺基酸做為構築分子的胜肽分子庫。其後，相關的研究報告猶如雨後春筍般發表於各種專業期刊上，自此組合化學的技術很快地受到重視及採用。組合化學的研究真正如火如荼地展開是從1990年開始，至今在醫藥及材料方面都有廣大的應用和快速的發展。

組合化學的實驗步驟依序可以分為「合成」、「檢測」、「篩選」、「鑑定」及「再確認」，其中又以分子庫的「合成」及「篩選」較為重要。

分子庫的合成

組合化學在「合成」的設計概念上，大致可以分成「平行式合成法」與「分配－混合式合成法」，兩者最主要的差異在於：前者可以同時獲得個別的產物，而後者所得到的產物則混合在一起。

在合成方式上，又可以分為「固相合成」與「溶液相合成」。在固相合成的程序上，首先需要選擇適合反應的固體小珠粒，即固相支撐體與相連接的鍵鏈劑，以利合成產物後切下。另外，以胜肽的合成來說，在過程中需要加入耦合試劑來參與反應，以便將具有保護官能基團的胺基酸連接到珠子上，然後移除保護基，再依重複的步驟將一個個所要合成的胺基酸依序接連到珠子上，得到一段所需的胜肽序列後，再將其從珠子上切下，如此不需要經過繁雜的純化過程，就可以得到純度相當高的產物。在此，我們將針對常用的組合化學固相合成法來介紹上述兩種合成概念，對於傳統式的液相合成則不再贅述。

1984年，蓋爾森等人首先提出利用平行式合成法的概念，建構由各種胺基酸做為構築分子的胜肽分子庫。其特色是將分子庫內所有的化合物都同步進行製備，利用特製的裝置將一系列的胜肽同步連接於各個探針上，此一多重探針裝置具有許多凹槽與凹槽尺寸吻合的棒狀探針接於盤蓋上。棒狀探針的材質為聚乙烯，末端接有經衍生化的酸性反應基團，也就是胺基酸合成的固相支撐體。實驗時，將具有保護基的各種胺基酸和反應試劑溶液置於各個凹槽內，進行合成後，即可將特定胺基酸接合於特定位置的探針上，並依照加入不同胺基酸的順序來做編排，建構一個接合於探針上的分子庫。這種方法的優點是不需將胜肽自固相支撐體上切下，即可進行後續的篩選工作。平行合成法所得到的每一個反應槽中的胜肽，將只具有單一且特定之胺基酸序列。

事實上，平行式合成法與真正的組合化學原理有些許差異，其最主要的優點是可以得到單一的產物且產物結構鑑定簡單，缺點是分子庫的大小受限於反應槽的數目，因此，所合成的分子數目將有所局限。

1988年孚卡（Arpad Furka）率先提出了分配－混合式合成法的概念，主要目的是希望能在短時間內製備數百萬個不同組合的胜肽。這種方法所應用的原理最符合組合化學的精神，因為它在最短的時間內可獲得最大數目的分子庫，而且可搭配輔助的高解析度分析方法篩選出所需的產物，並推測出產物的構築組塊及其原來的合成路徑。

目前已經有自動化的儀器上市，故此類實驗在經設計過後，只需準備一些固相支撐體及原料，即可讓儀器自動執行合成的工作。

以上這兩種合成方法最大的差異在於：平行式合成法受限於反應槽數目，所得之最終產物數量有限，但可以同時獲得個別的產物，結構鑑定上十分快速、方便。分配-混合式合成法的產物數量與每一組構築組塊之數目成指數關係成長，合成的分子庫數目龐大，但產物混合在一起，惟此法最具組合化學之精神。

分子庫的篩選、確認及再確認

分子庫製備最終目的多半是為了找尋最具生物活性的先導化合物，倘若分子庫內的化合物皆以不同濃度比例存在時，容易造成活性實驗結果的錯誤判斷。假如某一活性較低的化合物以較大量存在於分子庫內，則易被誤判為一高活性的化合物，所以分子庫內化合物必須以相同的莫耳比例存在，這點在合成上必須特別留意（一莫耳的定義為6.02 × 10的23次方個分子數目，莫耳比例用於表示參與反應的分子數目比例）。理論上，經由分配－混合成合成法得到分子庫中的每一組成分子是以相同濃度存在的。

如上所述，分配－混合式合成法合成出的產物是混合在一起的，因此面臨如何將合成出來的分子庫做有效地「檢測」、「篩選」及「再確認」的工作。在此我們就以我們實驗室關於細菌卵白素的實驗結果，來說明組合化學研究的流程。

在人體中，生物素或稱維生素H扮演很重要的角色，缺乏時會引起皮膚炎、嘔吐、肌肉疼痛等症狀，而細菌卵白素對生物素有很強的結合作用，一旦兩者有結合作用發生，生物素便失去了原有的生物活性。在1998年，我們成功地利用分配－混合式合成法來製備環狀胜肽（cyclic peptides）分子庫，並篩選出與細菌卵白素有強結合作用的環狀胜肽。在此之前，所有經由分子庫篩選出的分子與細菌卵白素的結合作用力均弱。

首先，為了建構水溶性的環狀胜肽–cyclo（AX₁X₂X₃X₄X₅AE）K-CONH₂，我們選取了八種胺基酸（X＝H、P、Q、Y、G、F、D及I，其構造請參照胺基酸的部分）做為構築分子來合成分子庫，如此可得到85＝32,768種不同胺基酸序列組合的環狀胜肽分子庫。可是如何在這些混合的分子庫中找出目標化合物呢？在評估所有常使用的分析篩選方法後，我們決定採用酵素連接免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），它是一種基於酵素免疫測定原理所發展出的高靈敏、高效率篩選技術。利用這個方法，我們將各個次分子庫逐一做篩選，最後找出了最具有抑制效果的環狀胜肽〔cyclo（AHPQFPAE）K-CONH₂；其構造請參照胜肽的部分〕。也就是說，所篩選出的環狀胜肽與細菌卵白素有很強的結合作用力存在，這個結果與過去文獻所報導的直線型胜肽（linear peptide）相比，結合作用力還要高上1,000倍左右。

酵素連接免疫分析法（ELISA） ：ELISA是結合「抗體高度專一性」及「酵素高催化效率」這兩項特色的先進分析及篩選技術。其作用原理是利用抗體的專一性去偵測原量的多寡，並以酵素快速放大或顯示其結果。酵素連接免疫分析實驗步驟概述：

1. 將抗體吸於載體表面上。2. 加入有色抗原與抗體相結合，以達到顯色效果（B）。3. 同時加入待測抗原及有色抗原，由於待測抗原會與有色抗原競爭抗體，使得顯色效能下降（D）。4. 若將B之顯色效能減去D的顯色效能，該數據可用來定量待測抗原的濃度。

藉由分配－混合式合成法並搭配高效率篩選方式，可以很快地從數目龐大的分子庫中篩選出具生物活性的物質。在我們確認最具生物活性環狀胜肽的胺基酸序列後，量產此一環狀胜肽，同時除了在實驗上決定其有效抑制常數外，亦進一步利用X光晶體繞射實驗，再確認其與細菌卵白素的三度空間分子層次結合作用情形。

組合化學的未來發展

組合化學研究之重要性與迫切性，以醫藥衛生為例來闡述最恰當。醫藥衛生向來為國家富強的重要指標，與我國相鄰的日本，國民的「平均餘年」長久以來均遠高於我國，去年日本更榮登世界「健康壽命」首位。雖然我國已實施全民健保且各種醫療設施完善，但迄今尚無新藥自製能力，每年所需藥物全賴從國外進口且花費龐大。再者，與組合化學息息相關的生物科技與藥物研發，早已被公認為21世紀最具前瞻性、創新性及國際性之產業。而且，製藥工業在美國已躍居獲利工業的首位。

有鑑於此，我國亦於國家經濟建設六年計畫中，將製藥工業列為十大新興產業之一，並成立多項生物科技鼓勵專案。行政院更於去年表示，生物技術產業為一項「今天不做，明天會後悔」的新興產業，而且每年將投資新臺幣二百億元的經費，全力進行生物技術產業的研發工作。組合化學之新技術開發與應用研究將有助於加速此一目標之達成，進而提升國家競爭力。

目前國內之組合化學合成技術及相關之高效率分析方法正處於發展初期，對產、官、學界而言，是屬於值得投入的領域。當前世界尖端科研的趨勢，很明顯地是以基礎科學配合應用科學為走向而發展出來的跨領域組合。近年來組合化學對抗癌、抗病毒與抗病菌感染之先導藥物研發，以及新一代催化劑、新電子與生化材料之研究已有革命性的影響，研究領域涵蓋基礎科學，如︰化學與生物學，以及應用科學，如︰醫學與材料工程學，且除了在開發新藥與生化材料有其重要性，在電子、磁性及異相催化材料的研發上業已展現可行性。

不可諱言，今日無論已開發或開發中國家，無不積極規劃並從事組合化學新方法之研究及新技術的應用，因此組合化學實為當今國際科研熱門主題之一，未來發展潛力無可限量。

深度閱讀

中國化學會（2000）組合化學專題報導，化學，58(1)。

資料來源

《科學發展》2002年5月，353期，56 ~ 61頁

科發月刊(5210)

組合化學在醫藥開發上的應用

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