蟲蟲危機–以線蟲做為模式生物
102/07/09
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郭承儒｜
成功大學生物化學暨分子生物學研究所
陳怡偉｜
成功大學生物化學暨分子生物學研究所
陳昌熙｜
成功大學生物化學暨分子生物學研究所
秀麗隱桿線蟲（註1）是當代生物科學研究上一種重要的模式生物（model organism）。早在1970年代，科學家悉尼‧布瑞納（Sydney Brenner）便開啟了線蟲研究的大門。起初布瑞納的主要目的是想找到一個如微生物般，體積微小，容易培養，並且可大量操作的多細胞生物，以進行發育生物學和神經系統的研究。
布瑞納一開始就設定這種生物所具有的細胞數目必須很少，以便進行細胞譜系的追蹤研究，但又要有足夠的數量進行遺傳學分析，最後他找到了線蟲做為模式生物，並利用遺傳學的方法研究發育生物學和神經系統。
自本世紀開始以來，以線蟲做為模式生物的研究，已囊獲3次諾貝爾獎的桂冠：分別是2002、2006年的諾貝爾生理醫學獎和2008年諾貝爾的化學獎。
2002年得獎人悉尼‧布瑞納、羅伯特‧霍維玆（H. Robert Horvitz）和約翰‧薩爾斯頓（John E. Sulston）因研究線蟲基因調控器官的發育和細胞凋亡的程序，而了解線蟲的基因如何調控細胞分化，發育成各種不同的器官，並且發現某些細胞的死亡其實是個體發育中一個已經預定且受到嚴格控制的正常程序。這研究對於分子發育遺傳學和細胞生物學有重大的貢獻。
2006年的得獎人安德魯‧費爾（Andrew Z. Fire）和克雷格‧梅洛（Craig C. Mello）則發現核醣核酸干擾基因表達現象（RNA interference, RNAi），其干擾機制是經由靜默（knock down）基因的表達，降低並減緩該基因原本的表現型。
這樣的發現在分子生物領域是很令人震驚的，因為分子生物學的中心教條告訴我們，遺傳物質去氧核醣核酸（DNA）轉錄形成核醣核酸（RNA）後，RNA再被轉譯形成蛋白質而產生功能。在這當中，RNA不過是扮演把DNA轉變成蛋白質的媒介而已，在當時鮮少有人會想到這不起眼的傳訊者會直接參與調控基因的表達。這項重大的發現目前已在長尾獼猴臨床應用上證明，或許未來有機會可以運用核醣核酸干擾現象的技術治療人類癌症或退化性疾病。
2008年得獎人馬丁‧查爾菲（Martin Chalfie）的貢獻是把水母綠色螢光蛋白基因（green fluorescent protein, GFP）轉殖入線蟲的神經細胞中，使得原本在水母體內表現的綠色螢光蛋白可在水母之外的生物體中發亮。這項技術的發展同樣對整個生物化學和醫學領域產生重大的效益。
這微小而又優雅的生物於1999年開始被用來研究綠膿桿菌的致病性和毒理因子，其後對於大腸桿菌、沙門氏菌、黏質沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等各種人類致病菌的研究，就如雨後春筍般展開，並為線蟲生物學開啟了一扇新的研究大門－以線蟲做為模式生物研究宿主和病原菌間的交互關係。
為什麼是線蟲
在自然環境中，線蟲是一種存活在土壤中的生物，而土壤中同時有許多微生物，線蟲與這些微生物可能已經共同演化了超過6億年。從微生物的觀點來看，微生物藉由一些特殊的毒理因子毒殺或感染線蟲類動物、無脊椎動物，藉以抵抗或避免被這類生物捕食。
另從宿主的角度來看，線蟲則是以微生物為食的食菌生物，牠們為了生存會啟動一些特殊的反應機制，以抵抗微生物的侵入與感染。而這些被線蟲啟動以抵抗微生物的反應機制，對比於哺乳類生物的免疫反應，其演化上的保留性是相當高的，像是p38有絲分裂活化蛋白質激酶、DAF-2類胰島素、類鐸受體等訊息傳遞路徑，都同樣可以在線蟲與哺乳動物中找到。
這樣的保護機制與訊息路徑經過數億年的演化仍可以保留下來，勢必在宿主抵抗致病菌的防禦機制中扮演相當重要的角色。由於線蟲這種無脊椎動物只擁有先天免疫系統，沒有複雜的後天免疫系統，因此當線蟲遇到微生物感染時，只會活化先天免疫系統，並且誘導抗真菌或抗細菌的防禦機制。
這一特性使得科學家得以比較容易地在細胞的層級研究宿主如何抵禦病原菌。再者，如先前所提，線蟲是一種食菌生物，因此腸道是抵禦細菌感染的第一道防線，以啟動防禦病菌的免疫反應，而腸道是線蟲最大的器官，可行使消化食物、吸收養分的能力，與哺乳動物無異。加上線蟲腸道的解剖特徵跟哺乳動物的腸道非常相似，都具有細胞分化特性，也都分化出微絨毛等結構，非常適合用來研究細菌如何感染、侵略宿主的致病機轉。
線蟲發育周期極短，從幼蟲成長到具有生殖能力的成蟲僅需約3天的時間，而線蟲成蟲壽命又只有2～3周左右，相較於其他模式生物來說，線蟲的研究可以在短時間內結束，因此非常適合用來快速研究致病菌。
再者線蟲非常容易培養，只需在直徑約6公分的培養皿上倒入1公分厚的洋菜膠，並塗上些許的細菌供線蟲食用，就可以餵養數以千計的線蟲，大大節省了空間成本。又線蟲的體形非常小，成蟲僅約一至二公厘長，培養時，也可置於多孔盤中，進行全面性的高通量篩選，可大幅提升實驗的速率，節省時間成本。這也是其他模式生物難以達到的！
線蟲體形雖然小，但身體透明，容易實行顯微注射技術，研究人員可以把DNA送進線蟲體內，產生出基因轉殖動物，應用於基因表現相關領域的研究。線蟲透明的身體還有另一個好處，只要使用簡單的光學顯微設備，就可以即時地觀察並追蹤線蟲被病原菌感染的情形與病情的嚴重程度。
此外，線蟲也是第一個全基因序列被完整解開的多細胞動物，其完整的基因序列於1998年被解開，並解析出有百分之四十的比率與人類相似。線蟲的全基因體核醣核酸干擾庫（註2）已經建立完成，對研究線蟲如何抵抗致病菌感染有很大的幫助。
綜觀上述，線蟲這種便利的模式動物，對於研究宿主跟病原菌的交互作用，以及針對宿主抗病機制與病原菌致病機轉的藥物開發研究，可以扮演重要的篩選媒介。另藉著這些研究了解其與致病菌間的交互作用，或許可以對應於人類與病原菌的交互作用，產生另一種不同角度的觀點。
下面以筆者實驗室所建立的出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic escherichia coli O157:H7, EHEC）感染線蟲的研究模式為例，來呈現線蟲與致病菌間的交互作用與實際實驗操作方式。
出血性大腸桿菌是一種隨著食物或水源傳播的感染性致病菌，會造成患者腹瀉、出血性結腸炎、溶血性尿毒症等症狀，嚴重的病患甚至會發生腎衰竭的情形。在自然環境中，出血性大腸桿菌廣泛共生於牛羊等牲畜體內，當這些細菌隨著這些牲畜的排泄釋放到農場土壤中時，使得自然界的線蟲有機會與它們接觸，因此線蟲遭遇出血性大腸桿菌的情形，以及線蟲接觸出血性大腸桿菌後產生的交互作用，是自然存在的反應，而不會只是局限在實驗室才發生的狀況！
在實驗室裡培養線蟲時，給予線蟲攝食的標準菌株是無致病性的大腸桿菌OP50，做為實驗控制組。由觀察線蟲餵食出血性大腸桿菌的生存曲線，可發現餵食出血性大腸桿菌的線蟲生存曲線跟控制組相比，明顯減短許多。據此，可以推測線蟲會被出血性大腸桿菌感染、毒殺。
更進一步，利用顯微鏡觀察線蟲餵食控制組大腸桿菌OP50和實驗組出血性大腸桿菌後的外部形態，也能看出外觀上有明顯的差異。餵食出血性大腸桿菌的線蟲相較於控制組體色較蒼白，體長明顯較短，身體還有些許皺縮，呈現比較不健康的形態。因此，可以判定出血性大腸桿菌確實對線蟲有感染的情形。
出血性大腸桿菌是一種腸道菌，會寄殖在宿主腸道中，利用轉殖有綠色螢光蛋白的大腸桿菌OP50和出血性大腸桿菌餵食線蟲，並觀察細菌在線蟲腸道內的情形。由於線蟲的體色透明，因此可以清楚地觀察轉殖有綠色螢光的菌體在線蟲體內的情況。發現餵食實驗組出血性大腸桿菌的線蟲，其腸內腔有明顯撐大的情形，甚至有桿狀綠色螢光細菌的顯現，這也暗示線蟲的腸內腔中可能有大量的出血性大腸桿菌存在。
相反地，在餵食轉殖有綠色螢光蛋白的大腸桿菌OP50的組別中，只有微弱的綠色螢光表現，並沒有看到線蟲腸內腔擴大表現的情形。由上述實驗結果可推論，出血性大腸桿菌會寄殖於線蟲腸道內，使得線蟲腸道擴張，進而毒害線蟲，造成線蟲的生存曲線較短，最終導致線蟲的死亡。
現今科技蓬勃發展帶動了醫療技術與設備的精進，使得人類壽命增長，卻也引出許多新型疾病及藥物濫用的隱憂，特別是抗生素濫用產生大量新型抗藥性細菌，使得尋找新型藥物或新型的治療方式成為迫在眉睫的難題。藉由了解宿主如何抵抗致病菌，發展更好的預防及治療的方式，應可以提供新藥開發明確的道路。甚者，進一步了解致病菌如何感染、侵入宿主的致病機制，更是重要的研究方向。
利用線蟲這模式動物做為宿主，對於了解病原菌的致病因子的分子功能，和宿主遭受感染時體內抗病機轉的調控，有很大的幫助。線蟲提供一利用完整生物個體的方式，可快速驗證建立於宿主基礎特性的假設。也可在整隻蟲體遭受感染的情形下，進行高通量藥物的篩選。這樣新穎的篩選方式，是現今其他模式生物難以比擬的，更為疾病致病機轉研究與新藥開發的漫長路途，挹注了一股嶄新且強而有力的能量。
註1：秀麗隱桿線蟲是種生活在土壤裡，以微生物如大腸桿菌為食的生物，成蟲體長約為1公厘，細胞數959顆，發育周期約3天，成蟲壽命約20天。其完整的基因體序列已於1998年定序完成，適合用來研究宿主與致病菌間的交互關係。
註2：線蟲是食菌生物，因此可藉由餵食線蟲「可以表現特定雙股核醣核酸的細菌」，達到核醣核酸干擾線蟲基因表現的效果。這些可以抑制線蟲基因表現的特定雙股核醣核酸細菌已被科學家建立，並形成一個基因庫，稱做全基因體核醣核酸干擾庫，目前有16,757株細菌，涵蓋範圍約可干擾90％的線蟲基因。
