原始生殖細胞–魚類生物工程的嶄新工具
94/02/14
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吉崎悟朗 等｜
東京海洋大學（著）
邱如玉｜
臺灣海洋大學水產養殖研究所（編譯）
廖林彥｜
雪霸國家公園管理處（編譯）
林永發｜
雪霸國家公園管理處（編譯）
郭金泉｜
海洋大學水產養殖系
現在的科技已經可以在植物體外，透過細胞培養技術從植物的癒合組織細胞，培養出一個完整的植物個體。同樣地，藉由嵌合體的技術，可將老鼠囊胚內細胞團所建立的全能性胚幹細胞，培養成老鼠的個體。而且，因為胚幹細胞擁有全能性，還經常使用在基因轉殖和基因剔除的實驗上以探討基因的功能。
在魚類方面，可轉變成為個體魚的細胞株（cell line），也可以應用在很多方面，例如基因轉殖魚的量產、基因剔除的研究和藉由細胞凍結技術以保存魚類的遺傳資源等。雖然有這麼多好處，但到目前為止，把「體外培養的細胞株轉變成為個體魚」的技術仍不夠完整，而且尚未進行系統性的研究。不過，現在的科技已經可以透過「生殖系嵌合體魚」的製造技術，在體外把魚類的細胞株轉變成為個體魚。
原始生殖細胞–生物工程的主角
把一隻老鼠的胚幹細胞，透過遺傳修飾程序經基因改造後，再用顯微注射的方式送入代理孕母囊胚中，就可在嵌合體老鼠的生殖腺內，分化成為具有功能的配子。若再透過受精程序，便可製造出帶有特殊修飾基因組的老鼠個體。而研究者也曾在斑馬魚和青魚將魚上做過多次試驗，他們採用來自分割球細胞的魚類胚幹類似細胞，並建立起許多細胞株，可惜至今這些細胞株仍無法經由嵌合體及受精程序製造出個體魚。
值得注意的是，未來如果打算將這些供核者的細胞應用在「細胞媒介基因轉殖」技術上，供核細胞就必須具有「可轉變成為具有功能的配子」的能力。所以，為建立具有分化成為配子能力的細胞株，必須把研究焦點放在原始生殖細胞上，因為這是生殖細胞的胚前質物。
虹鱒–實驗上的好材料
虹鱒（Oncorhynchus mykiss，英名 Rainbow trout）屬於陸封性的鮭魚，原本分布於北美洲，臺灣的種源引自於日本，主要作為水產養殖。但仍有些個體被放流或逸出於高山溪流中。虹鱒與其他鮭魚相同，生活在冷水域而乾淨的高山溪流中，主要以水棲昆蟲為食物來源。性成熟的虹鱒可以長至 40 到 90 公分，體型較臺灣的櫻花鉤吻鮭（鮭科（Salmonidae），學名 Oncorhynchus masou formosanus (Jordan et Oshima, 1919)）大的許多，因此領域性也較大，攻擊性亦較兇猛。因此若臺灣櫻花鉤吻鮭選擇域外放流的溪流中，已經有虹鱒的蹤影，將對櫻花鉤吻鮭的生存造成威脅。
在各種魚種中，虹鱒有很多優點，因此拿來作為研究對象。例如，虹鱒胚剛孵化時的全長為15公釐，由於體積夠大，大到足以讓研究者在顯微鏡下，直接用鑷子就能把含有原始生殖細胞的生殖隆起，從孵化胚中分離出來。而且，虹鱒還是多產的物種，只需一次受精，就可獲得數以千計，含有綠色螢光蛋白標記的原始生殖細胞的轉殖基因胚。一般而言，在魚類生殖隆起中的原始生殖細胞的數目很少，若要進行移植或體外培養實驗時，多產就成為一個很有利的條件，而虹鱒正好具有這個優點。
為了方便觀察，研究者把活鱒胚的原始生殖細胞以綠色螢光蛋白標記。目前在科學上也已發展出以綠色螢光蛋白做標記，然後利用流式細胞儀大量分離活的原始生殖細胞的技術。
流式細胞儀可以用來純化被綠色螢光蛋白標記的原始生殖細胞。從孵化期的胚上切下來的生殖隆起，經胰蛋白酶溶解分散，透過流式細胞儀可分類成為被綠色螢光蛋白標記的細胞，和不被綠色螢光蛋白標記的細胞。前者直徑大約20微米，是一種具有圓形外觀、偏心的核、以及充滿顆粒的細胞質，這些都是原始生殖細胞所具有的典型之形態特徵。
魚類的第一個代理孕母
然而，為了獲得具有功能的配子，仍需努力把原始生殖細胞轉變成為精子和卵子的技術找出來。日本東京海洋大學的吉崎悟朗教授及其研究團隊曾以櫻鮭為代理孕母，在櫻鮭的腹膜腔內移植虹鱒的原始生殖細胞，藉由這個方法從櫻鮭生產虹鱒子代，這是世界上魚類的第一個代理孕母研究成功的報導。
又為追蹤外源的原始生殖細胞在代理孕母體內的表現，研究人員先利用綠色螢光蛋白基因，把原始生殖細胞標記，然後再把孵化胚生殖隆起內的原始生殖細胞植入代理孕母。被植入到代理孕母腹膜腔內的原始生殖細胞，會朝向代理孕母的生殖隆起移動並形成群體聚落。到後來，來自供核者虹鱒的原始生殖細胞，在不同種（櫻鮭）的代理孕母的生殖腺中增殖，並分化為成熟的卵子和精子，再透過這些製造的配子受精，可生產出許多來自供核者的活仔魚。
以原始生殖細胞製造「有生殖能力」的細胞株，應是建立魚類「細胞媒介基因轉殖」技術的重大突破，也是科學界在非鳥類脊椎動物中的第一次報告。尤其令人訝異的是，來自供核者的原始生殖細胞，在代理孕母的生殖腺中未發生免疫排斥現象。這現象可能與供核者的原始生殖細胞，在代理孕母的細胞性免疫開始啟動前就已移植有關。事實上，免疫系統在一些魚種孵化的時候並未完備，也不成熟，所以原始生殖細胞的移植技術，應可適用於大多數魚種，也可進行同種或異種之間的移植。
借鯖魚腹 生鮪魚仔
經過成熟和授精過程後，原始生殖細胞便具有轉變成為個體的能力。所以，研究者可以利用原始生殖細胞作為基因轉殖的載體細胞。倘若再和同源重組技術結合，就能利用體外培養的原始生殖細胞，代替胚胎幹細胞來執行基因標的作用。又因為魚卵或胚的凍結保存技術，至今尚未成功，所以，保護魚類遺傳資源唯一可行的方法，目前只能用保存活的魚個體來做。因此，這些原始生殖細胞，又可讓保育魚類遺傳資源的保存工作變得更容易。
如果可以凍結保存從各種魚類分離出來的原始生殖細胞，再讓這些細胞透過「生殖系嵌合體」代理孕母的技術轉變成為活魚，這樣的技術在保護瀕臨絕種魚種的遺傳工作上特別有意義。這是因為，萬一受關注的物種快絕種時，透過這套生物工程技術，可把凍結保存的原始生殖細胞移植入種源關係較接近的物種胚中繁殖，如此一來，這個物種等於再次復活了。
這套技術的另一個應用，被稱為「代理種魚技術」。例如，黑鮪體型龐大，世代時間很長，而且在種苗生產時，需要廣大的飼養空間和密集的勞力，這樣的生產成本顯然較高。然而，我們可不可能把黑鮪種苗的原始生殖細胞，移植送入種源關係相近，但體型較小、世代時間較短的鯖魚胚胎內接續繁殖呢？原始生殖細胞在代理種魚體內是否可以增殖，並且產生來自供核者魚種的精子和卵子呢？這是生物工程研究者深感興趣的課題。
此外，利用不孕的代理孕母，如三倍體個體，應該可以降低產生代理孕母子代的機率！由於原始生殖細胞具有轉變成為個體魚的能力，如果能再添加一些創造力和想像力，或許在魚類生物工程的領域中，可為原始生殖細胞技術的應用，帶來更多新的設計靈感呢。
