人類的好伙伴—昆蟲桿狀病毒：醫生的助手
100/08/03
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胡育誠｜
清華大學化學工程系
林進裕｜
清華大學化學工程學系
基因治療
你可以想像在未來的世界裡，走進醫院看病是一個什麼樣的情況嗎？你生病的時候，醫生給你的藥物，不是一般的口服化學治劑，也不是蛋白質藥物，而是基因藥物。預防疾病接種疫苗時，打的針劑不是大家熟知的減毒疫苗，也不是所謂的死毒疫苗，而是新型的基因疫苗。當確診罹患了某種先天性疾病時，不再需要靠一輩子的服藥消極地減緩症狀，只要施打一些基因藥物就可治癒。當器官受損時，醫生可以施以基因治療幫助器官重建。這些像是未來科幻的情節，其實科學家正在努力研究中。
基因治療主要是把重組的DNA分子放在適合的基因載具上，傳遞到動物或人類細胞染色體內。這些外源的重組DNA分子，在進入細胞染色體後，會利用細胞內的工具進行DNA的轉譯，形成訊息RNA及轉錄生產重組蛋白，用以修補或置換患有遺傳性、新陳代謝或癌症等疾病的細胞內的致病基因，使細胞恢復正常功能。或者在已喪失功能的基因外，輸入額外的正常基因，以製造必要的產物，使病人恢復健康。
基因載具的功能就像交通工具一般，假如要由臺北到高雄，可以選擇搭飛機、火車、汽車、高鐵，騎摩托車、腳踏車或徒步前往，差別主要在於使用各種交通工具的安全性和效率不同。而在交通工具上的我們，就是基因藥物裡的DNA分子。
在1960∼1970年間，科學家開始嘗試以病毒做為載體，把外來基因送入特定的細胞。隨著技術的發展和對疾病的認知逐漸加深，基因治療的觀念因而衍生。在1980年代末期，就有人利用反轉錄病毒把腺苷酸脫胺酶（adenylate deaminase,ADA）基因導入T細胞中，以治療嚴重複合性免疫缺陷症，這樣的做法說明了基因治療的可行性。
神奇的幹細胞
近年來，由於幹細胞容易在體外增殖，具有分化成為脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、肌腱細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、心臟細胞、血管細胞等和自我更新的特性，已成為基因治療和組織工程領域重要的細胞來源。
幹細胞的來源範圍相當廣泛，包括來自早期胚胎或胚胎組織的胚胎幹細胞，或來自骨髓、周邊血液、臍帶血、肝臟、結締組織等部位的成體幹細胞。這些成體幹細胞扮演著人體修復和再生的關鍵角色，在特定條件下，成體幹細胞可對稱分裂為兩個新的子代幹細胞或功能細胞，也可不對稱分裂為一個幹細胞和一個功能細胞，因而使組織或器官維持生長和老化的動態平衡。
基因治療結合幹細胞
既然幹細胞有自我修復、維持器官生長，以及讓缺損組織再生的功效，它是否可以結合基因載體，做為以細胞為平臺的基因治療工具呢？目前已經有許多科學家利用由骨髓或脂肪組織取得的間葉幹細胞，進行基因工程改質，並在動物疾病模型中確認可用於修補許多器官或組織。
使用幹細胞療法的優點，在於幹細胞移植後有調節受移植者體內免疫細胞的功能，並且會分泌多種細胞激素，可加速刺激受移植者缺陷組織或病灶組織的痊癒。例如，會分泌肝細胞生長因子、轉型生長因子、第二型纖維母細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子、第二型間質金屬蛋白酶、第九型間質金屬蛋白酶等細胞激素，造成受移植者體內的微環境變化，而提升治療效果。
因此，在1990年以後，許多科學家結合治療型的基因使間葉幹細胞改質。例如，使細胞表現第八凝血因子、第三型介白素、人類生長荷爾蒙、紅血球生成素、第二型骨型態蛋白等，並在動物體內表現。這些表現出來的基因重組蛋白質也確定可以調控幹細胞分化，並刺激組織再生。
基因治療載體的選擇
基因治療載體的選擇就如同選擇交通工具一般，目前基因治療載體可大致分為病毒載體和非病毒載體兩大類。非病毒載體主要是藉由質體（plasmid）把外源基因送入細胞染色體。因質體無法像病毒載體可利用細胞上面的受器來增加進入細胞的效率，因此需要憑藉一些外來化合物或電刺激的方式幫助DNA進入細胞中。甚至使用基因槍的方式，直接把DNA分子塗布在奈米金粒子上面，再射擊穿透過細胞膜，把治療性DNA分子送到體染色體內。
這些方法都是透過物理性質的改變，達成基因遞送的目的。而其中常見的化合物，多是酯類的衍生物或是帶有靜電的物質，其效果與電刺激方式相同，藉由改變細胞膜的通透性，使外來的DNA能夠有效地進入細胞中。這稱為轉染過程的效率約介於10∼70％之間，且因為轉染細胞的不同，會有效率上的顯著差異。
在病毒載體中，常見的有反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒，以及由免疫不全症候群病毒延伸改造出的慢病毒載體等。
反轉錄病毒攜帶的遺傳物質是RNA，在感染宿主細胞後，首先經反轉錄過程形成DNA，進而嵌入宿主細胞的染色體，並且嵌插在染色體上的DNA會經由細胞的繁殖過程，傳遞至下一代的子細胞中。因此若使用反轉錄病毒做為基因治療載體，則外來基因可有長效性的表現。
然而若細胞當時不處於分裂周期進行繁殖，反轉錄病毒並無法轉導，且病毒本身無法耐受離心濃縮。儘管目前這兩種缺點已漸漸改善，但真正的問題在於基因表現的調控，以及插入位置的不確定性。因為外來DNA嵌插進入染色體，會造成基因序列的延長、錯位亂序，以及中斷，這樣的缺點容易造成宿主細胞癌化，減少基因治療的應用範圍。
相對於反轉錄病毒，腺病毒的遺傳物質是DNA。腺病毒可轉導分裂中和不分裂的細胞，因此十分適合於活體使用。然而對動物施打腺病毒，易造成強烈的免疫反應，使得病毒本身遭免疫系統破壞而無法長期表現外來基因。再者，也因為其免疫反應而使得腺病毒無法對同一個活體施打二次以上。雖然已有第二代、第三代的病毒藉由剔除更多病毒本身基因以降低免疫反應，但生產較不易且昂貴。
腺相關病毒是一種基因體極小的DNA病毒，特性介於反轉錄和腺病毒之間，不僅可嵌入受轉導細胞的染色體，也可轉導分裂中或不分裂的細胞。此外，施打這病毒進入活體後，不會造成強烈的免疫反應，因此應用性似乎較前兩者高。然而因為基因體很小，所以只能接納小片段的DNA，也限制了腺相關病毒的應用範圍。
慢病毒的特性十分接近於反轉錄病毒，它是由免疫不全症候群病毒（HIV）所改良研發出的新型基因載體。不同於反轉錄病毒，它對於分裂中或靜止不分裂的細胞都可以轉導，可以轉導的細胞種類也非常廣，效率介於60∼80％之間。
相較於以上介紹的病毒基因載體，桿狀病毒很早就開發用於重組蛋白的生產，它感染的宿主細胞也認定局限於昆蟲細胞。雖然哺乳動物細胞並非桿狀病毒的天然宿主細胞，但是在1995年，發現桿狀病毒可把外來基因送入肝癌細胞，也相當有效地利用哺乳動物細胞啟動子，在細胞內驅動報導基因的表現。科學家接著又陸續發現，桿狀病毒也可以轉導其他多種哺乳動物細胞，如神經細胞、人類纖維母細胞、胰臟細胞、卵巢細胞等，因而發展出利用桿狀病毒做為哺乳動物細胞體內或體外基因治療的研究。
桿狀病毒載體的特性
相較於上述目前廣泛使用的病毒載體，桿狀病毒做為哺乳動物基因治療載體有以下幾項特點：
病毒在轉導細胞後不會複製和產生細胞毒性，且DNA會隨著時間降解而不會插入宿主染色體中，這對施以基因治療的細胞後續是否產生突變相當重要；病毒在人體中並沒有已存在的抗體會加以攻擊，因此可降低病毒施打劑量；病毒本身DNA（約13萬4千對鹼基）遠較其他做為基因載體的病毒大，因此可以攜帶較大和較多的外來基因（至少可達3萬8千對鹼基）進入細胞內；可用簡便的操作方式大量製備出高效價的病毒，並可利用超高速離心或固定化金屬親和力層析法濃縮純化；可在一般生物安全等級第一級的實驗室操作。
前3項特性使桿狀病毒可做為有效且安全的基因載體，後兩項則使桿狀病毒可安全、容易地大量製備，這些特性都有助於以桿狀病毒在哺乳動物細胞中做為基因治療載體的發展。然而主要缺點是外源基因表現時間短暫而大量，通常大量表現在轉導後3到10天之間，隨後降低到近於背景值。可能的原因在於基因體較為龐大，因此在受轉導細胞中，比較容易在短時間內和細胞內的酵素（例如RNA聚合酶或轉譯過程需要的酵素）結合並生產蛋白質。
但也是因為它的基因體很大，在細胞中容易被DNA切割酶辨識出，認為是外來物而清除掉。然而這缺點目前已有科學家利用重複病毒轉導，或基因工程改造桿狀病毒的方式加以改善。綜合以上特性，桿狀病毒確有成為基因治療工具的潛力。
應用於現代醫學的潛力
目前已有直接施打基因重組桿狀病毒以治療癌症或神經細胞的神經膠質瘤等研究。例如，在免疫缺陷老鼠皮下植入前列腺癌細胞，使小鼠長出明顯的前列腺癌組織後，利用帶有抗血管新生因子DNA（如內皮抑素或血管抑素）的基因重組桿狀病毒，施打前述已經長出明顯前列腺癌組織的小鼠，可以觀察到這些小鼠的前列腺癌組織體隨病毒施打時間的延長而顯著地萎縮。
科學家也曾經利用重組桿狀病毒攜帶A型白喉毒素DNA，進行小鼠的神經膠質瘤治療，這些成果都顯示桿狀病毒確實有潛力應用於癌症組織的治療。此外，也有團隊利用桿狀病毒攜帶禽流感病毒的表面專一性抗原基因，直接以這病毒施打動物，使動物對這抗原產生對應的抗體。未來假設真的遇到禽流感病毒的感染，動物體內就已經有保護的抗體了。
再生醫學上的應用
目前已知桿狀病毒對人類或實驗兔的初代細胞具有極佳的轉導效率，實驗已證實對軟骨細胞、骨髓或脂肪來源的間葉幹細胞，有大於8成以上的轉導效率。筆者實驗室的研究已證實，以攜帶人類第二型骨型態蛋白基因的桿狀病毒改質初代軟骨細胞，並以旋轉式生物反應器培養，製備出的工程軟骨移植入紐西蘭白兔後，可在8周內修復膝關節軟骨缺損。
另一實驗同樣利用這桿狀病毒改質人類骨髓間葉幹細胞後，移植到免疫健全的實驗鼠頭蓋骨缺陷，在手術後一周內，骨的缺損位置已有新骨生成。
最近，筆者研究團隊更利用這病毒混合表現人類血管內皮細胞生長因子的新型病毒，轉導紐西蘭白兔骨髓或脂肪來源的間葉幹細胞，成功地修復紐西蘭白兔的腿骨大範圍缺陷。這些研究成果證實桿狀病毒可以結合幹細胞治療，用於以往臨床醫師認為相當棘手的外科重建手術。不只提供臨床醫師未來一個可以運用的幫手，更為桿狀病毒基因治療應用於人類再生醫學建立一個嶄新的里程碑。
需要努力的地方
如同其他病毒載體，桿狀病毒載體在臨床應用上最可能被質疑的是安全性。儘管桿狀病毒過去被視為非常安全，但近年來陸續發現桿狀病毒在進入實驗動物細胞後，會產生許多類的細胞激素，例如介白素、干擾素、癌凋亡因子等。而觀察桿狀病毒的表現時間也過於短暫，未來真正要應用於需長時間治療的疾病時，恐怕桿狀病毒在活體表現的重組蛋白量可能會不足。
再者，目前應用桿狀病毒於活體動物疾病模型的治療的觀察時間都不長，術後更長的時間是否會引發其他病症，目前都屬未知。
人類醫療的發展史，從遠古時期的藥草治療，施行了數千年之久，拜有機化學知識演進之賜，到近代才有化學合成藥物，隨後再演進到發酵提煉製成的抗生素，以及最近逐漸興起且重要的蛋白質藥物（例如胰島素、紅血球生成素等）。這些一步一步的演進，都為人類提供更大、更多的醫療福祉。隨著醫學科技的進展，未來人類會進展到使用基因藥物，而當下的我們正朝那目標邁進。
