於是美國喬治亞大學的研究團隊挑選變色蜥(Anolis)開發利用CRISPR-Cas9的爬行類模式系統,因為過去半個世紀,變色蜥已是研究爬行類演化、生理、發育的核心模式系統。變色蜥在加勒比海地區經歷過趨異演化,在形態、行為、生理上分化出大量的物種。同時,學者發現了許多趨同演化的例子。因此關於變色蜥的科學文獻異常豐富。
研究人員選擇沙氏變色蜥(Anolis sagrei)做實驗。一般而言,以CRISPR-Cas9更動特定基因座,必須藉顯微注射完成—趁胚胎仍處於單細胞階段時進行,但是對變色蜥受精卵做顯微注射非常困難。
一來,變色蜥實行體內受精,而且雌性可以把精子長期儲存在輸卵管內,很難掌握注射時機。其次,變色蜥的成熟卵很大(直徑約8 mm),含有大量卵黃,非常脆弱,不容易操弄。最後,卵子受精後便裹上卵殼,不待排出體外胚胎就開始發育,可是變色蜥的卵與鳥卵不同,殼不硬又沒有氣室,不方便對其中的胚胎動手腳。這些困難不是變色蜥特有的,而是許多爬行類的共同特點,因此以變色蜥開發的實驗系統可以應用於其他物種。
研究人員的目標是生產酪胺酸?的基因tyr,因為許多脊椎動物物種喪失了tyr之後仍然能夠存活。此外,酪胺酸?調控黑色素的生成,tyr喪失功能後會造成肉眼可以分辨的表現型,例如「白子」。
結果研究人員發現,針對卵巢中未成熟的卵(直徑不超過5 mm)做顯微注射,成功率最高;直徑超過6 mm的,則敬謝不敏。每一隻雌蜥蜴最多有10粒卵子接受顯微注射,合計21隻雌蜥蜴共有146粒卵子接受CRISPR-Cas9注射。卵子受精孵化後,9隻幼蜥至少有一份tyr已喪失功能,其中4隻的表現型是白子—兩份tyr都喪失功能。
參考資料:Introducing the world’s first gene-edited lizard, by H. Murphy, New York Times, April 5, 2019.