生物科技的應用：醫療上的利器–改造的綠膿桿菌外毒素Ａ
93/01/13
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陳宗嶽｜
成功大學生物科技研究所
粘茂偉｜
成功大學生物科技研究所
生物技術的基礎–基因工程
所有的生物都是由細胞所組成，每個細胞中都含有由去氧核醣核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）組成的遺傳物質，DNA包含了關於生物結構和功能的完整資訊，無論這個生物是一種細菌、一株植物還是一個人。通常DNA被比喻為一串密碼序列，這些密碼包含決定生物體內能製造哪些蛋白的指令，就是決定製造哪些酵素和激素、細胞產生哪些化學反應和活動、以至於生物具有哪些特徵的指令。就個別特徵來說，視為「足夠」產生這項特性的密碼，就叫做一個基因。
一九五三年華生（James Watson）和克立克（Francis Crick）提出DNA雙螺旋結構模型，宣告了分子生物學的誕生，在生命科學史上翻開了劃時代的一頁，而「基因工程」是過去50年來分子生物學的重大成果，也是分子生物學的延伸應用。
基因工程技術是生物技術的基礎，從動植物改良、人類疫苗及醫藥開發，到人類基因體研究計畫，都可看見基因工程技術的影子。雖然基因工程技術誕生至今僅三十多年，但其貢獻卻無可估量。基因工程是一種用來修改、重組DNA結構的技術，修改是為了某些特定目的而做的，而且這些修改是可以傳承到子代的。藉著基因工程，我們可以改變細胞的特性，進而改變生物體的外在特徵或內部行為。
與基因工程相關的術語很多，如遺傳工程、基因操作、重組DNA技術、基因選殖及分子選殖等。這些與基因工程相關但也有一定差異的術語，易造成定義上的誤解。一般而言，所謂基因工程是指在體外把核酸分子插入病毒、質體或其他載體分子，構成遺傳物質的新組合，並使之進入原先無此類分子的寄主細胞內，而能持續穩定繁殖的技術。或者可說是對DNA大分子遺傳基因進行體外操作，把不同基因依設計藍圖重新組建，再引入細胞中，構成具有新遺傳特性的生物。
整體而言，基因工程包含的主要組件有：分離的目標基因片段與具篩選標誌的載體分子、可切割基因的限制酵素、及可連接DNA的連接酵素等。基因工程的步驟是，利用一種可以裁剪特定DNA序列的「剪刀（限制酵素）」，從一生物體內剪下特定目標基因的DNA，然後用可以連接不同DNA片段的「膠水（連接酵素）」，把特定的目標基因DNA片段與具篩選標誌的載體（質體DNA）接合，形成重組的DNA。再把重組的DNA經由基因轉殖的方式送入宿主細胞中，使宿主細胞表現那段殖入基因應有的特性。
所以藉由基因工程的方法，我們可以修飾、改變一個基因，使該基因得以為我們所用，同時也可以廣泛應用於農業、醫學診斷、轉殖動物、轉殖植物等領域，例如，提高農作物產量的轉殖基因作物及抗病蟲害作物；經由遺傳工程產生的細菌或轉殖基因動物提供製造醫學治療所需的蛋白質或抗生素藥品等；甚至人類的基因治療、與人類疾病相關基因的診測、動植物種原的育種、飼料添加劑、食品、蛋白醫藥、免疫抗體、疫苗的改良及開發，都可以應用這項技術。
綠膿桿菌
綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）是革蘭氏陰性桿菌，因為這種綠膿桿菌對養分的需求少，容易在自然界生長、繁殖，尤其可以抵抗多種殺菌劑、消毒劑或抗生素，是目前院內感染的主要致病菌。綠膿桿菌經常由傷口、燒傷部位、外科手術或治療、檢驗用各種插管，甚至使用不當的隱形眼鏡，而侵入人體。綠膿桿菌對健康的人威脅不大，但經常侵犯囊狀纖維瘤患者，或因燒傷、惡性腫瘤而造成免疫力缺失的人，以及因器官移植而使用了免疫抑制藥物的病人。
一旦綠膿桿菌侵入患者組織或血液後，常出現各種不同的臨床症狀，如急性眼內炎；或在囊狀纖維瘤患者身上，出現慢性呼吸道感染，進而演變成慢性肺炎；在免疫力缺失的癌症患者或嚴重的燒傷病人身上，則出現急性的肺炎或菌毒血症。院內感染綠膿桿菌所引起的肺炎或菌毒血症，致死率更高達70％，其中主要的致病因子是綠膿桿菌外毒素Ａ（Pseudomonas exotoxin A，簡稱PE）。
綠膿桿菌外毒素Ａ是綠膿桿菌所分泌的毒素中毒性最強的，它可以抑制真核細胞蛋白質合成，是引起患者發生肝中毒，病情急速惡化甚至死亡的主因，95％以上由臨床分離出來的綠膿桿菌都會分泌這種毒素。
綠膿桿菌外毒素Ａ
綠膿桿菌外毒素Ａ可以抑制真核細胞蛋白質合成，早期對綠膿桿菌外毒素Ａ所做的基礎研究，對於它的構造與各部功能之間的關係已有了清楚的了解。目前已知綠膿桿菌外毒素Ａ的蛋白結構主要有三個區域，在毒素進入細胞，抑制蛋白質合成上各有不同的功能。自從對綠膿桿菌外毒素Ａ的結構與功能有了清楚的了解後，就有科學家開始利用基因工程的方式改造並利用綠膿桿菌外毒素Ａ，使其具有醫療的用途，並且能應用到臨床醫療上。
目前綠膿桿菌外毒素Ａ在醫療上的用途有：將抗體與其結合成為免疫毒素，藉由抗體作為引導媒介，使這個免疫毒素進入某些特定細胞中，抑制這些細胞的蛋白質合成，達到破壞這些特定細胞生長的目的，特別是在抗癌藥物的研究上；運用綠膿桿菌外毒素Ａ開發綠膿桿菌疫苗，它是一種很好的疫苗蛋白，不論製成無毒的綠膿桿菌外毒素Ａ片段或與其他抗原融合，都可以運用到疫苗發展上；針對肝癌細胞的治療方面，利用綠膿桿菌外毒素Ａ能夠攜帶蛋白質或DNA進入細胞中的特殊功能，可以開發出極佳的基因治療工具或蛋白質治療藥物。
免疫毒素的發展與運用
許多癌細胞的表面含有突變或過度表現的腫瘤基因，有些腫瘤則表現出某些分化或其他與腫瘤有關的抗原，正因為在人體中，這些表面特定的蛋白質抗原只出現在癌細胞表面上，所以這些細胞表面標記就成了治療癌症的目標。由於針對特定目標的治療方法，不會傷害到正常的細胞，因此就有利用基因工程的技術，把可以辨識癌細胞表面特定標記的抗體，與對細胞有毒性的綠膿桿菌外毒素Ａ連接在一起，形成針對癌細胞的重組免疫毒素，有助於癌症的治療。
除了與抗體融合的免疫毒素之外，也有以基因工程的技術來改造綠膿桿菌外毒素Ａ的受體結合區，例如改造成具表皮生長因子，使綠膿桿菌外毒素Ａ變成對表皮生長因子受體具有專一性。而為了加強表皮生長因子和其受體結合的能力，以增加含表皮生長因子的融合毒素殺死癌細胞的能力，也可針對融合毒素的表皮生長因子部分進行點突變，以加強融合毒素對於過量表現表皮生長因子的癌細胞的毒殺能力，使這個融合毒素能成為更具有醫療用途的專一性毒素。
綠膿桿菌疫苗的開發
傳統的細菌疫苗多注重在刺激宿主產生抗體，以對抗病原菌或加強巨噬細胞的噬菌能力，進而阻止細菌在患者體內繁衍。因為綠膿桿菌會經由各種途徑感染宿主，產生不同的臨床症狀，而綠膿桿菌在患者體內繁殖時，所產生的許多有毒代謝產物，對各種臨床症狀也有不同程度的影響，因此就目前數種綠膿桿菌疫苗而言，都無法有效防止綠膿桿菌外毒素Ａ所造成的病害，因此單獨一種抗體無法對患者提供足夠的保護作用。
近年來則嘗試發展一種無毒性、抗原性穩定的多成分綠膿桿菌疫苗，其成分包含了外膜蛋白和綠膿桿菌外毒素Ａ、彈性蛋白和鹼性蛋白所製備的類毒素。此疫苗在水貂和人類體內的初步測試，證實可以刺激宿主產生抗體，中和綠膿桿菌有毒的代謝產物，而且可以加強巨噬細胞的吞噬和殺菌作用。但缺點是這種多成分的疫苗不但製造麻煩，而且很難控制每種成分的比例、含量，在接種疫苗後，免疫的效果差異也很大。
因此如何依據已知的綠膿桿菌致病機轉，利用基因工程發展更安全、有效的綠膿桿菌疫苗，是科學家的研究重點之一。綠膿桿菌外毒素Ａ在綠膿桿菌致病機轉中的重要性非常高，在受到綠膿桿菌感染後而能夠存活下來的病人體內，都有很高濃度的抗綠膿桿菌外毒素Ａ抗體，反之不幸死亡的患者血清內，抗綠膿桿菌外毒素Ａ抗體的濃度則明顯偏低。此外，抗綠膿桿菌外毒素Ａ抗體也可以幫助免疫力有缺失的病人，免於受綠膿桿菌感染後的生命威脅。
但是綠膿桿菌外毒素Ａ的毒性很強，以往都是利用福馬林處理，使綠膿桿菌外毒素Ａ蛋白變性，成為沒有毒性的類毒素之後，再來免疫動物，生產抗血清，但仍有可能造成有害的毒素。因此就有科學家利用基因工程的技術讓綠膿桿菌外毒素Ａ的毒性消失，但仍然保留大部分抗原性，而成為無毒性的綠膿桿菌外毒素Ａ類毒素，利用這種類毒素，可以有效刺激動物產生抗體，中和綠膿桿菌外毒素Ａ的毒害作用。這比先前用福馬林處理綠膿桿菌外毒素Ａ製造類毒素疫苗的傳統方法安全，而且抗原性也較強。
另外也可利用基因工程的技術，把有毒性的區域去掉，改換成綠膿桿菌的多種外膜蛋白，形成重組融合蛋白，而發展一種多成分綠膿桿菌疫苗。經動物實驗顯示這種疫苗確實可以刺激宿主產生抗體和細菌表面結合，促進巨噬細胞的吞噬作用，不僅可以抵抗綠膿桿菌外毒素Ａ，而且可以產生對抗外膜蛋白的抗體，對於所有不同血清型的綠膿桿菌都具有抵抗力，因此是一種更有效的新型綠膿桿菌疫苗。
除了利用基因工程的方式進行綠膿桿菌本身的疫苗改良及開發外，綠膿桿菌外毒素Ａ也可以做為一個抗原攜帶蛋白，藉由綠膿桿菌外毒素Ａ的特性，提升該抗原的免疫效果，進而應用到其他不同的疫苗研究上。例如利用重組DNA的方法，把去毒性的綠膿桿菌外毒素Ａ作為與促性腺素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone, GnRH）接合的攜帶蛋白，以細菌作為生產去勢疫苗的工具，接種後的動物都能夠產生很強的抗GnRH的抗體，抑制該動物的性腺發育與生殖功能。
相較於外科手術去勢的方法，免疫去勢能更方便有效地達到動物生育調控的目的。近年來，由於生物技術的快速進展，未來可利用重組DNA技術生產畜用免疫去勢疫苗，大量生產品質一致且純度高的抗原蛋白，降低生產成本，以最少的免疫注射劑量使副作用降至最低，而達到免疫去勢的目的。
基因輸送系統
基因治療是未來疾病治療的方式之一，但真正由單一基因決定的遺傳疾病，大約只占全部遺傳疾病的0.5％，目前正研究如何運用基因治療的方式治療一些由非單一基因決定的遺傳疾病，並進一步推廣應用到其他疾病上。
基因治療似乎遠景無限，但仍然有許多問題需要克服，如體細胞所做的基因治療，是將取自人體的細胞，如白血球、骨髓細胞、肝臟細胞、肌肉細胞等，在體外做組織培養，然後經由各種化學、機械或生物方法（如利用以基因工程修飾過的無毒性病毒做為基因媒介），把經過基因工程方法矯正的或正常的基因送入這些細胞裡，等待充分證實了這些細胞的活性與安全性後，再把這些「治療過」的細胞送回人體，如此可望在人體內發揮正常基因的作用。
但是這種在體外處理的方法，由於矯正過的細胞仍免不了衰亡，所以必須定期地接受追加治療，因此執行上仍不夠方便。理想中，如果能將「正常」的基因，經由注射或吸入的方式，送至基因作用的目標器官或細胞，用來更正目標細胞的缺陷基因，那就可以使疾病得到控制或消失。
一項成功的基因治療包含了許多因素，其中最首要的就是如何使「正常」基因能夠順利地到達目標細胞中，然後再考慮如何使「正常」基因適當地表現等問題。目前較常使用於基因治療的基因輸送系統，是生物載體基因輸送系統，這類生物載體主要是以病毒為主，如反轉錄病毒和腺病毒，但使用病毒做為輸送載體，必須考慮它是否能把基因輸送至特定的組織細胞，以及病毒是否會造成危害的生物安全性等問題，因此細胞受體調解法就成了較佳的取代方式。
由於細胞受體調解法在以往大多是利用化學方法，使配體與DNA結合區結合，因此沒有辦法控制與配體結合的DNA結合區數量，也沒有辦法控制每一DNA結合區結合到配體的數目，因此利用基因工程的方法加以改進，應該能進一步提升細胞受體調解法的效果。
以基因工程的技術，使綠膿桿菌外毒素Ａ的受體結合區和移位區與做為DNA結合區的胺基酸序列結合，形成具攜帶DNA能力的融合蛋白。其中所含的DNA結合區帶有正電荷，能結合帶負電荷的DNA，利用綠膿桿菌外毒素Ａ的受體結合區與哺乳動物細胞膜上的低密度脂蛋白細胞受體結合後，進入細胞的內膜體中，再經由綠膿桿菌外毒素Ａ移位區的作用進入細胞質中，而將DNA送入細胞內，因此這個融合蛋白可以應用在基因治療的基因輸送工作上。另外，也可以利用基因工程的技術修改綠膿桿菌外毒素Ａ的受體結合區，使此一DNA輸送融合蛋白具有特定細胞的專一性，進而可以更加廣泛地應用在基因治療上。
基因工程是一項新的技術，因為這項技術能夠運用並改造生物，充分利用生物資源，所以具有不可忽視的發展潛力。以綠膿桿菌外毒素Ａ為例，它原本是一個非常毒的毒素，經過基礎研究之後，我們可以利用基因工程的方式加以改造，使其成為具有多種醫療用途的蛋白質，諸如抗癌用免疫毒素、疫苗發展及基因治療等多種用途。
但也因為基因工程具有永久改造生物基因、進而改造生物的可能性，所以也潛在著無法預知的副作用。因此在各層面的基因工程操作及使用上，都需要充分評估管理，才能在不影響生物的自然生態平衡下，達到造福人群的功效。
附錄
基因工程組件與步驟：基因工程的步驟是，利用一種可以裁剪特定DNA序列的「剪刀（限制酵素）」，從一生物體內剪下特定目標基因的DNA，然後用可以連接不同DNA片段的「膠水（連接酵素）」，把特定的目標基因DNA片段與具篩選標誌的載體（質體DNA）進行接合，形成重組的DNA。再把重組的DNA經由基因轉殖的方式送入宿主細胞中，使宿主細胞表現那段殖入基因應有的特性。
綠膿桿菌外毒素Ａ毒化細胞過程：區域 I 中的受體結合區，負責和哺乳動物細胞膜上的α 2 巨型球蛋白／低密度脂蛋白細胞受體結合後，再經由細胞攝粒作用進入細胞的內膜體中。當綠膿桿菌外毒素Ａ被內膜體內的蛋白酵素切割後，綠膿桿菌外毒素Ａ區域 Ⅱ（移位區）會把包含區域 Ⅱ和具有毒性的區域 Ⅲ 片段由內膜體移位至細胞質中。具有毒性的區域 Ⅲ 和一部分的區域Ⅰ是腺核苷雙磷酸糖化作用區，它們抑制了細胞蛋白質的合成作用，最後導致細胞死亡。
運用綠膿桿菌外毒素Ａ開發綠膿桿菌疫苗：綠膿桿菌外毒素Ａ是一種很好的疫苗蛋白，不論製成無毒的綠膿桿菌外毒素Ａ片段或與其他抗原融合，都可以運用到疫苗發展上。在肝癌細胞的治療方面，利用綠膿桿菌外毒素Ａ受體結合區與移位區能夠攜帶蛋白質或DNA進入細胞中的特殊功能，可以開發出極佳的基因治療工具或蛋白質治療藥物。
