生物農藥：植物的醫病良方–幾丁質分解性拮抗細菌
94/07/06
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黃健瑞｜
臺灣大學植物病理與微生物學系
陳昭瑩｜
臺灣大學植物病理與微生物學系
植物也會生病
大多數人都以為只有人或飼養的寵物會生病，其實植物也會生病，這些病除了由各式各樣的蟲子咬食所造成的直接傷害外，也有因細菌、真菌、線蟲和病毒等四大病原微生物所造成的植物傳染病。
對許多以植物維持生計的人來說，植物一生病他們就頭痛了，已經有許許多多不同種類看得見的害蟲需要防治，再加上肉眼看不見的微生物在旁邊攪局，要有好收成實在不容易，嚴重的話，還會造成可怕的飢荒。像1845-1846年的愛爾蘭大飢荒，就是因為作為主食的馬鈴薯被晚疫病菌全面攻擊所造成的，導致100萬人餓死，另有150萬人移民至美國新大陸。1943年在孟加拉，也因為水稻遭受胡麻葉枯病的危害，造成200萬人因飢餓而死亡。因此，人類如果沒有照顧好植物，最後受害的還是人類。
如何不讓植物生病
很可惜，植物和動物就是不一樣，不能用注射疫苗來誘發對病原微生物的抵抗力，因此最簡單的方法，就是噴上薄薄的一層藥劑，來防止病原微生物的感染。早在1885年，米拉德就發展出最早的植物用藥劑「波爾多液」，因為能有效防治葡萄露菌病而被稱為「聖水」。直至今日，已有許多不同的化學農藥在巿場上販售，農藥成為植物病害防治的主流。
用農藥殺菌，對防治植物病害來說，發揮了很大的功效，也可達到立竿見影的效果。但是用久了，問題也來了，能夠耐得住農藥的病原菌開始出現，而且愈來愈多，農藥的效果因此開始變差，栽培者就得用更濃的藥劑量去抑制病害發生。然而更具抗藥性的病原菌也就跟著產生，這樣惡性循環下去，農藥用量便十分龐大，對整個生態平衡產生很大的衝擊。
因此，就設計出來替代化學農藥使植物比較不容易生病的方法，例如種植物之前先讓土壤曬太陽殺菌，或者是輪流種各種不同的作物，用輪作來減少病原菌的數量。此外，還有許多不同的方法，其中一種可說是最有潛力的方法，就是從大自然中尋找這些植物病原菌的天然剋星，來對付植物的病原菌。這也就是所謂的生物防治，基本的道理就是「一物剋一物」。
拮抗細菌
為了進行有效的生物防治，相當多能抑制植物病菌的拮抗微生物已被分離出來，有真菌也有細菌。如今已有不少有效的拮抗細菌被商品化，例如枯草桿菌、螢光假單胞菌、鏈黴菌等。這些拮抗細菌的抑菌能力，主要是以菌體所產生的抗生物質為主，拮抗細菌利用其二次代謝物質，來抑制植物病原菌的危害。
另外，有些拮抗細菌會產生幾丁質分解酵素，與拮抗細菌產生的其他種類抗菌物質有協力或加成作用，可加強細菌的拮抗能力。因此能夠產生幾丁質分解酵素的拮抗菌株，常被認為是篩選生物防治菌株的重要指標。
幾丁質是由乙醯葡萄糖胺鍵結連接而成的聚合物，不溶於水、酸、鹼溶液及有機溶液中，是多數真菌細胞壁的重要組成物之一。此外，它也存在於線蟲體壁和卵塊外層。幾丁質雖然如此強韌，卻會被幾丁質分解酵素水解，而從聚合物還原成乙醯葡萄糖胺單元體的狀態。因此，能夠產生幾丁質分解酵素的細菌，就有可能用牠產生的酵素來分解真菌細胞壁，發揮抑菌的作用。如果拮抗細菌能夠同時產生幾丁質分解酵素及抗生物質，就可能因幾丁質分解酵素的存在，而更加提升抑菌能力。
使用幾丁質分解性細菌進行植物病害的生物防治，可分成兩種方式：一種是直接運用會產生幾丁質分解酵素的野生型拮抗細菌；另一種是利用生物技術，讓原本不會產生幾丁質分解酵素的拮抗細菌，得到來自其他菌種或生物的幾丁質分解酵素的基因，以產生外源幾丁質分解酵素，提升抑菌能力。
在直接施用幾丁質分解性拮抗細菌防治植物病害的例子方面，黏質色拉雷菌產生的幾丁質分解酵素A，能抑制引發植物病害中的白絹病菌生長，並減少白絹病菌對大豆以及立枯絲核菌對棉花的為害情形。如果直接用幾丁質分解性黏質色拉雷菌的培養菌液處理大豆，在溫室中進行病害防治試驗，便能夠有效地防治白絹病及立枯病。同樣地，把這種幾丁質分解性黏質色拉雷菌，施用於種植4星期的草坪上，可以抑制草皮夏季斑駁病。
此外，幾丁質分解性聚團腸桿菌也可以讓溫室栽培的棉花苗枯病或立枯病發病率，顯著降低達60％以上。如果把這種聚團腸桿菌的幾丁質分解能力去除，會發現突變菌株無法顯現出防治病害的能力。如果把幾丁質分解性豚鼠產氣單胞菌施用於溫室栽培的棉花和大豆時，可以讓棉花受到立枯絲核菌或萎凋病菌感染的情況降低，也可減少白絹病菌對大豆的為害。
幾丁質分解性嗜麥芽寡食單胞菌的培養液，可以用來防治高羊茅、黑麥草等的草皮黑斑病，尤其是添加幾丁質的培養液，防治效果更好。至於幾丁質分解性嗜麥芽寡食單胞菌菌株，能抑制馬鈴薯包囊線蟲卵的孵化，使馬鈴薯免於受這種線蟲危害。液化澱粉芽孢桿菌也有能產生幾丁質分解酵素的菌株，所產生的幾丁質分解酵素可抑制真菌生長，這種菌株也可用來防治植物的病害。
除了直接施用幾丁質分解性拮抗細菌之外，還可以把利用分子生物學方法得到的幾丁質分解酵素基因，導入到原本不會產生幾丁質分解酵素的拮抗菌中，增加對病原真菌的抑制能力。這些研究主要是利用黏質色拉雷菌的幾丁質分解酵素A基因，如讓大腸桿菌產生來自於黏質色拉雷菌的幾丁質分解酵素A，並把它施用於土壤中，就可保護大豆不受白絹病菌的侵犯。
更有效的方法，則是把黏質色拉雷菌的幾丁質分解酵素A基因，送入原本就存在於植物根部的細菌細胞裡，利用這些穩定生活於植物根部的細菌，產生具有抑菌能力的幾丁質分解酵素，可以使得病害防治的效果有最佳的持續性。例如把黏質色拉雷菌的幾丁質分解酵素A基因，送入分離自蘿蔔根部的螢光假單胞菌中，施用後可抑制蘿蔔萎凋病的發生。
此外，把黏質色拉雷菌的幾丁質分解酵素A基因送入螢光假單胞菌中，用來處理棉花幼苗，則可減少棉花受立枯絲核菌侵害的程度；處理菜豆，則可降低菜豆受立枯絲核菌為害的程度。因此，直接施用有效的幾丁質分解性拮抗細菌，或是利用生物技術改良後的幾丁質分解性遺傳工程拮抗細菌菌株，都能夠有效地防治植物病害。
分離與篩選
幾丁質除了存在於真菌的細胞壁之外，也是蝦蟹殼的主要成分之一，因此，在實驗室裡要對環境中的幾丁質分解性細菌進行篩選及分離時，可在培養基中加入取自蝦蟹殼的幾丁質，當做培養細菌的主要碳氮素源。自蝦蟹殼萃取幾丁質時，可以把磨碎的蝦蟹殼用磷酸處理後，再用水稀釋，並洗去經磷酸處理後自粗材料中流出的雜質，最後讓幾丁質沈降，經離心收集後得到的膠狀幾丁質，便可供製作培養基使用。
幾丁質培養基製備好後，可用來培養根圈土壤或以病菌誘釣的細菌，細菌在培養的過程中能分解幾丁質，使得菌落周圍產生透明的區域，稱為透明圈。同時在培養基上，把前一步驟培養所得的細菌，拿來和植物病原真菌進行對峙培養，篩選出產生抗菌代謝物的拮抗菌株，並在溫室中進行初步的病害防治試驗，以便篩選出具有生物防治潛力的菌株。最後進行實地的田間試驗，以了解幾丁質分解性拮抗細菌在實際應用時的病害防治能力。
有效防治百合灰黴病
國際上有許多實驗室都在從事幾丁質分解性拮抗細菌的研究，在筆者的臺大植物病理與微生物學系的分子植物病理與生物防治研究室中，也進行了相當深入的探討。
首先利用遺傳工程的方法，改良一株源自豐原的拮抗性枯草桿菌，這個菌株本身不會產生幾丁質分解酵素，但會產生對真菌極為有效的抗菌物質。希望藉由送入的幾丁質分解酵素基因，使得改良菌株能夠同時表現幾丁質分解酵素及其他抗生物質，以提高對病原真菌的拮抗能力。筆者的研究室所使用的幾丁質分解酵素基因，來自於芽孢桿菌，把編碼是幾丁質分解酵素A1的基因，由聚合酵素連鎖反應擴增出來後放入載體中，送入拮抗性枯草桿菌的細胞內，並篩選出抑菌能力有顯著提升的轉形細菌。
抑菌試驗結果顯示，轉入幾丁質分解酵素A1的枯草桿菌轉形菌株，對立枯絲核菌菌絲生長的抑制能力，較野生型菌株有著顯著的提升，也能更加有效地抑制百合灰黴病菌孢子的發芽及菌絲的生長。此外，轉入幾丁質分解酵素基因的枯草桿菌，能夠在更高稀釋倍數下，維持極為有效的抑菌能力。因此，經由這些試驗證明，利用幾丁質分解酵素基因進行拮抗菌株的改良，確實可以提升菌株病害防治的能力。
除了利用遺傳工程技術改良拮抗細菌外，也從百合根圈分離出許多幾丁質分解性細菌，其中有一株幾丁質分解性蠟狀芽孢桿菌，牠的培養濾液能夠有效抑制百合灰黴病菌孢子的發芽。如果把這種細菌懸浮液噴灑在百合葉片上，能有效地抑制灰黴病菌的感染，於是筆者的研究室針對這一拮抗菌株的幾丁質分解性與抑制百合灰黴病的關係，作了進一步的探討。
首先利用蛋白質變性電泳配合酵素活性染色的方法，初步得知這株蠟狀芽孢桿菌可能具有產生兩種幾丁質分解酵素的能力，之後利用功能性篩選的方式，從菌株的基因庫篩選到其中一個分子量較大的幾丁質分解酵素基因。接著又藉由純化幾丁質分解酵素的方法，部分純化得到另一個分子量較小的幾丁質分解酵素，經由N端胺基酸定序、序列比對及分子選殖，篩選到另一個幾丁質分解酵素基因。
接下來分別利用大腸桿菌蛋白質表現系統表現及純化這兩個幾丁質分解酵素，並進行灰黴病菌孢子發芽影響試驗。發現分子量較大的幾丁質分解酵素，具有極高的抑菌能力，而分子量較小的幾丁質分解酵素，其抑菌能力極弱。因此，認為分子量較大的幾丁質分解酵素，在蠟狀芽孢桿菌菌株的拮抗能力中扮演重要的角色。分子量較小的幾丁質分解酵素，則可能是與另一個幾丁質分解酵素有著協力作用，以提升菌株抑菌的能力。
由於幾丁質分解酵素可以作為對抗植物病原真菌的武器，或是當作輔助其他抑菌物質的工具，如果能篩選出具有抑菌能力的幾丁質分解性拮抗細菌，或是利用遺傳工程方法改良已經篩選出來的拮抗菌株，都可有效地防治植物病害或是更加提升拮抗菌株防治病害的能力，也可減少植物病原真菌因大量接觸化學藥劑或抗生物質而產生的抗藥性問題。因此，幾丁質分解性拮抗細菌是植物病害防治的良藥，應持續善加利用這大自然的微生物資源。
