人工肝臟的新製法
95/05/15
瀏覽次數
15712
蕭長春｜
長庚大學臨床醫學研究所
鄞志修｜
清華大學化學工程學系
肝病是臺灣最常見的本土病，在衛生署的十大死因統計中，慢性肝病、肝硬化和肝癌都名列前茅。根據本世紀初的統計，臺灣每年平均約有5千人死於慢性肝病和肝硬化所造成的肝衰竭。臺灣在慢性肝病和肝硬化死亡率上的排名是全世界第2位，僅次於南韓。
雖然現代的醫學進步，已發展出許多治療肝臟疾病的藥物，B型肝炎疫苗的推廣也明顯降低臺灣人染上B型肝炎的比率。然而，肝臟被喻為人體中最沉默的器官，沒有神經的分布，因此，像是酗酒、藥物、或是過度疲勞而對肝臟開始造成損傷時，病患並不會有知覺。等到病患察覺不對勁時，往往已經達到末期而難以醫治的地步。
對於肝臟疾病末期的病患來說，「換肝」仍是目前醫學界公認的最佳治療方法。不過，肝臟的捐贈者非常有限，因此，大部分需要換肝的病患都在等待期間死亡。另外，並非所有需要換肝的病人都符合換肝條件，肝癌、酒癮患者、合併有其他重症的病患，或是年紀較大的病患，都會被排除在換肝手術的名單之外。
由於國人器官捐贈的風氣還不是十分盛行，再加上臺灣的成年人中，有15～20％是B型肝炎帶原者，他們的肝臟是不能捐贈的，因此可謂是「一肝難求」。在臺灣，能夠獲得肝臟移植而存活下來的肝病病患人數，大約是肝病死亡者的2％。
人工肝臟的發展
為使每位末期肝病患者都有重生的機會，大約在1960年醫學界便提出開發「人工肝臟」輔助系統的構想。期望人工肝臟能像洗腎機般清除病人體內的代謝廢物，以分擔病人部分的肝功能，使肝病患者能夠支持到進行換肝手術，或者是等待病患的肝臟自行復原。
人工肝臟大多是由單支到數支管柱所組成的裝置，管柱內置有透析膜或填充特殊吸附材料，或是把肝細胞培養在管柱中。當血液經由管柱內的管道通過人工肝臟時，人體內的廢棄物便被濾除，人體所需要的物質則從人工肝臟釋放到血液中。最後，淨化過後的血液離開人工肝臟再送入人體。
人工肝臟的發展分為兩大方向，即機械性人工肝臟和生物性人工肝臟。前者類似洗腎機，除了利用透析方法外，並採用離子交換樹脂和活性碳來去除體內的代謝廢物。雖然機械性人工肝臟在研發上較容易，但只能提供代謝廢物移除的功能，無法提供肝臟其他的生化代謝功能，臨床實驗結果指出這類裝置對於重症患者的輔助效果不佳。
生物性人工肝臟以肝細胞為核心元件，理論上具有完整的肝功能，能夠發揮如同肝臟一樣的機能，因此在人工肝臟發展上較受到重視。不過，開發生物性人工肝臟長久以來一直遭遇到的最大挑戰，便是肝細胞來源短缺的問題。前面說過，捐贈的肝臟非常珍貴，通常就直接供肝臟移植之用，哪裡還會再分一些肝細胞做為其他用途呢？
肝細胞的供應方案
是否能取得足夠的肝細胞是人工肝臟開發的關鍵。理論上，一個人工肝臟至少需要填裝150克的肝細胞，這相當於150億個肝細胞或十分之一的肝臟。在目前，要取得這麼多的肝細胞只有兩種方案，就是大量培養不朽化人類肝細胞株或使用動物肝細胞。
成熟的肝細胞不具有增殖能力，無法在體外大量培養，不過可利用基因轉殖使肝細胞擁有不斷增殖的能力，而成為不朽化細胞株。雖然不朽化人類肝細胞容易培養，也能大量增殖，然而這種細胞卻帶有重大的缺陷：不朽化人類肝細胞的功能遠不如正常的人類肝細胞。因此，採用不朽化人類肝臟細胞的人工肝臟雖然已經進入臨床實驗階段，但實驗結果並不理想。
動物肝細胞是人工肝細胞來源的另一種方案，常用的動物是豬。豬的肝細胞容易取得，而且成本較低，因為養豬相較於細胞培養來說，所使用的設備及技術在成本上都低廉許多。然而，使用動物細胞的重大隱憂卻是可能帶來異種疾病感染的風險。另外，目前的技術還不能使豬的肝細胞培養在人工肝臟內仍能長期保持原有的肝功能。而且，豬肝的肝功能和人肝不完全一樣，少數的研究指出，使用人類肝細胞的人工肝臟仍較其他物種的肝細胞更能提供治療效果。
肝細胞來源的新希望
幹細胞是體內的原始細胞，平時處在不活動的狀態，隱身於人體各處組織中。當某處組織的細胞因為老化或受傷而損失時，位在附近的幹細胞便活躍起來，進行分裂與分化，以補充損失的細胞。自從幹細胞能夠在實驗室中分離、培養，並且能夠再分化成為成體細胞後，幹細胞便成為再生醫學的希望，可做為修復人體的材料。
肝臟具有很強的再生能力，即使因為藥物傷害、病毒感染或手術切除而剩下30％的肝細胞，仍能在短時間內再生而回復原狀。因此，許多研究者嘗試利用肝臟幹細胞來生產肝細胞。然而，由於人類肝臟不易取得，難以進行研究。骨髓幹細胞或臍帶血幹細胞則較容易取得，也有人能在體外培養，並利用生長激素誘導分化成具有肝細胞特徵的似肝細胞。
不過，無論是採用肝臟幹細胞，還是骨髓幹細胞或臍帶血幹細胞，目前在這方面的研究所遭遇到的最大挫折，都在於這些細胞非常難以在實驗室中大量增殖。這些幹細胞在人體內所占的比率非常低，通常低於百分之一到萬分之一，如果這些分離出來的細胞無法大量增殖，那麼也就無法產生足夠的肝細胞供醫療用。這一瓶頸仍有待科學家的努力。
胚胎幹細胞的應用潛力
胚胎幹細胞是取自囊胚時期的胚胎，比起取自成體的幹細胞更為原始、更為年輕，因此，胚胎幹細胞具有不斷再生和多潛能分化的能力，可大量增殖並分化成人體內兩百多種成體細胞。自從人們知道幹細胞的存在後，便開始探討再生醫學的可能。不過，在幹細胞的研究上遭遇許多困難，使得再生醫學的進展一再受到阻礙。胚胎幹細胞的出現便提供再生醫學另一個選擇的方向。
目前阻礙人類胚胎幹細胞相關研究的障礙，主要在於倫理及法律上的爭議，使得科學家們無法進行更大膽的嘗試。但是，胚胎幹細胞所具有的獨特優勢，使得它仍然深受矚目而不斷有研究資源持續投入。
雖然在醫療或學術研究上使用肝臟幹細胞、骨髓幹細胞或臍帶血幹細胞，並沒有倫理及法律上的束縛，然而科技上的瓶頸使得幹細胞的研究進展緩慢。這些幹細胞除了難以增殖之外，還有疾病傳染的疑慮。幹細胞的品質取決於捐贈者的健康狀況，骨髓幹細胞和臍帶血幹細胞的採集較容易，可取自健康的捐贈者，然而，我們幾乎不可能從健康的人體上取得肝臟幹細胞。
胚胎幹細胞的分化
在體外培養中，胚胎幹細胞的生長與分化遵循著胚胎發育的過程。胚胎幹細胞的增殖一般採用平面貼附培養，但若想讓胚胎幹細胞分化出各種成體細胞，則必須先使其進行胚體形成，才會進一步產生各種成體細胞。胚體是一種類似胚胎的構造，如同胚胎一般，具有內胚層、中胚層和外胚層，每個胚層可各別分化出特定的成體細胞。
要使胚胎幹細胞形成胚體，必須採用一套截然不同的培養方法。首先，以酵素處理胚胎幹細胞團，使細胞打散，再把數百個胚胎幹細胞培養在一顆懸吊的培養液液滴當中。由於重力的關係，這數百個胚胎幹細胞會沉降在液滴底部，然後形成細胞團，進一步形成胚體。
不過，使用液滴製造胚體的方式非常耗費人力，而且胚體培養的時間不短，在這一段期間仍要為每個液滴更換培養液，這簡直是一件令人難以想像的工作。因此，另一種替代的做法是採用懸浮培養的方式，把胚胎幹細胞培養在細胞不易沾黏的培養容器中，如此一來，胚胎幹細胞仍會自行聚集成團，而形成胚體。
當胚體形成後，可繼續在懸浮的狀態下培養，胚體會自發性分化出各種成體細胞。然而，因為細胞持續不斷地增殖，使得胚體體積不斷增大而造成氣體及養分的供應困難，且胚體內的廢物也難以排放出去，最終會引起胚體內部發生壞死現象。因此，大多數的研究者都會在胚體形成後改用貼附培養方式，使細胞往二維空間增殖，以減輕氣體、養分和廢物的傳送問題。
提高肝細胞分化比率
雖然胚胎幹細胞會自行分化出各種成體細胞，然而，若放任胚胎幹細胞自行分化，便無法得到較高比率的特定細胞。例如，肝細胞僅占人體總細胞數的百分之二，假如這個花費大量人力、物力和時間的體外培養系統，也只能得到這麼低比率的肝細胞，那麼，採用胚胎幹細胞來取得肝細胞便不具經濟效益。
要讓胚胎幹細胞分化成為特定的成體細胞，目前所提出的策略是讓胚胎幹細胞處在分化成為肝臟的模擬環境中，以促使胚胎幹細胞都朝向肝細胞的方向去分化。前面說過，體外培養的胚胎幹細胞其分化過程類似胚胎發育的過程，我們可以藉由對胚胎發育的了解，得知胚胎發育過程中各種生長激素的調控方式，然後在培養過程中加入適當的生長激素，便可以誘導胚胎幹細胞分化成為肝細胞。除此之外，把胚胎幹細胞培養在特殊材料的表面上，例如膠原蛋白，也有助於胚胎幹細胞分化成為肝細胞。
不過，依據目前的技術，採用生長激素和培養材料並不能促使所有的胚胎幹細胞都分化成為肝細胞。另一方面，生長激素非常昂貴，使得肝臟細胞的生產成本難以降低。因此，近年來有些科學家採用基因工程的方法，來促使胚胎幹細胞分化成為肝細胞。
這種方法是把調控分化成為肝細胞的基因序列轉殖入胚胎幹細胞中，以強迫這些胚胎幹細胞啟動肝細胞分化的程式。這些經過基因轉殖的胚胎幹細胞，幾乎全部都能分化成為肝細胞，然而，因為仍未全然了解人類基因的運作方式，採用這種方法可能會製造出不正常的肝細胞，因此並未廣為採用。
一線希望
人工肝臟的發展已經將近50年了，然而到目前為止，仍無令人振奮的臨床研究成果。影響人工肝臟發展的關鍵，就在於如何能夠獲得來源穩定、數量充足、以及具有正常肝功能的人類肝細胞，而利用幹細胞來獲得人類肝細胞，已成為人工肝臟開發成功與否的一線希望。
我們期望能在不久的將來解決肝細胞的生產瓶頸，到那時，培養著人類肝細胞的人工肝臟將可望順利進入臨床實驗。從我國肝病比率向來遠高於歐美國家的情況來看，發展這套人工肝臟輔助系統有其必要性，而且深具意義。
人工肝臟製備流程
（A）胚胎幹細胞培養：胚胎幹細胞是以細胞團的方式培養，為了抑制胚胎幹細胞在這個階段發生分化現象，培養液中會添加抑制因子。因為胚胎幹細胞增殖速率較快，若能在這個階段培養出大量的胚胎幹細胞，會有利於後續量產成體細胞。（B）胚體形成：利用酵素處理，使胚胎幹細胞脫離培養皿並且分散開來，再把胚胎幹細胞培養在不易沾黏的特殊培養皿中。這些原本已經分散開來的胚胎幹細胞又會聚集成團，而成為胚體。（C）肝臟細胞誘導分化：取出培養好的胚體，移入已經預先披覆膠原蛋白的培養皿中，胚體就會貼附在培養皿上並分布開來。這些細胞仍會不斷增殖，但開始分化成各種成體細胞。為了產生較多的肝臟細胞，會在這個培養過程中加入各種生長激素，以控制細胞的分化方向。（D）人工肝臟應用：培養出來的肝臟細胞會再次用酵素處理，使細胞分散開來並脫離培養皿。然後，進行細胞純化的工作，去除掉其他種類的細胞，最後剩下來的肝臟細胞便灌注到人工肝臟中。製備完成的人工肝臟將連接到肝病患者身上以進行治療工作。
