生命會自尋出路–細菌抗藥性
92/04/17
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吳天鳴｜
中正大學化學暨生物化學研究所
朱延和｜
中正大學化學暨生物化學研究所
抗生素的發現
一九二八年，弗萊明（Alexander Fleming）在英國倫敦聖瑪麗醫院任職時，無意中在一個被污染的培養皿中發現，原本打算培養的葡萄球菌，它的生長現象竟被一種青綠色的黴菌（青黴菌）所抑制，因此弗萊明推測，青黴菌的分泌物應該具有抑制細菌生長的功效。由於這種抑菌物質是青黴菌的分泌物，因此弗萊明將其命名為青黴素（Penicillin），並於一九二九年，將其觀察到的現象首度發表在《英國實驗病理學期刊》，但當時並沒人理會這個醫學史上的重大發現。
由於當時弗萊明並無法將青黴素純化出來，因此他只能以含有微量青黴素的粗培養液進行實驗，雖然這些粗培養液能夠有效殺死試管中的細菌，但當餵食給被細菌感染的兔子或老鼠時，卻發現無抑菌的能力。這樣的實驗結果，使得弗萊明認為青黴素在動物體內無法繼續維持其殺菌的效力，因此在發表幾篇論文後，就終止了這個研究，使得抗生素的發展停頓了將近十年之久。直到一九三九年，才再度由澳洲旅英病理學家弗洛理（Howard Walter Florey）及其同僚錢恩（Ernst Boris Chain）繼續進行這個抗生素的研究。
一九四○年，弗洛理與錢恩首度從青黴菌的粗培養液中純化出青黴素，並用「老鼠保護試驗法」進行動物實驗。首先，他們將致死劑量的細菌注入八隻老鼠的體內，其中四隻再追加那些初步純化出來的青黴素，結果發現只有那些注射過青黴素的老鼠存活下來。一九四一年，青黴素首度進行人體試驗，並證實它能有效治療經由細菌感染的症狀。同年，弗洛理到美國商談青黴素的量產方法，再加上第二次世界大戰的催生，因此在一九四二年，青黴素得以順利量產與應用。於一九四五年，弗萊明、弗洛理與錢恩三人，更因發現、純化與量產青黴素而獲頒諾貝爾生理醫學獎。
由於青黴素的發現及其神奇的療效，引起了其他抗生素的研究風潮，例如一九四四年，瓦克斯曼（Selman Waksman）在灰色鍊黴菌中發現鍊黴素，由於鍊黴素是當時第一個能夠有效治療肺結核的藥物，瓦克斯曼因而獲頒一九五二年的諾貝爾生理醫學獎。他的成功，再一次引起全世界科學家對利用微生物生產抗生素的研究熱潮。
氯黴素、新黴素、土黴素、四環素都相繼在一九五四年前發現，而萬古黴素亦於一九五六年，由東方鏈黴菌屬的發酵物中純化出來，接著往後的十年間，新的抗生素如卡那黴素、灰黃黴素、巴龍黴素、林可黴素、慶大黴素、妥布黴素陸續發現，直到一九六○年代末期，人類可用來對抗細菌的武器已不下十數種，這樣蓬勃的抗生素研究結果，讓人類順利地脫離一九四○年代前飽受傳染病威脅的窘境。
抗生素的種類與功能
抗生素是一種相當理想的殺菌藥物，因其具有良好的選擇性毒性，也就是說，抗生素只會針對病原細胞作用，而對人體細胞無害。一般而言，由於菌體細胞與人類細胞在結構與代謝模式上有很大的差異，如前者具細胞壁，而後者無，使得抗生素容易辨識並攻擊病原菌，所以這類藥物的選擇性毒性通常比較高，也就是說其副作用比較低。
自一九四一年青黴素應用於臨床以來，經各方微生物學家及生化學家的努力，迄目前為止，已發現的抗生素種類已達幾千種之多，依據美國疾病管制局的檔案資料顯示，目前臨床使用的抗生素就有一百五十多種。這些抗生素主要是從微生物的培養液中純化，或者經合成或半合成的方法所製得，依其抑菌模式可概分為核酸合成抑制劑、蛋白質合成抑制劑、細胞膜功能抑制劑及細胞壁合成抑制劑四大類。
「核酸合成抑制劑」的代表性藥物有磺胺類、啉酮類及立放平，它們都是藉由抑制菌體核酸正常代謝而達到殺菌功效的藥物。例如在去氧核醣核酸（DNA）的合成過程中，細菌必須自行製造葉酸，而人類細胞則可以自食物中取得，因此，若能抑制菌體內葉酸的合成，就能停止細菌的增長，而且不會傷害人類細胞，像磺胺類藥物，就是利用這個差異而選擇性地殺害病原菌。另外，啉酮類藥物是抑制螺旋酶的活性，使DNA形成超螺旋結構的步驟受阻而達到滅菌的效果。立放平則是抑制細菌核醣核酸（RNA）聚合酶的活性，使得DNA轉錄RNA的動作受阻，最後因無法合成必要酵素而達到滅菌的功效。
蛋白質是生物體必要的代謝物質之一，因此在不影響人類細胞的正常代謝下，任何具專一性，並能有效抑制菌體內蛋白質合成的機制均可用來設計藥物，目前利用這種作用機轉的抗生素有胺基醣苷類、四環黴素類、綠黴素等，這些藥物一般歸類為「蛋白質合成抑制劑」。此類藥物之所以對菌體具有選擇性毒性，主要是在於菌體細胞與人類細胞的核醣體組成不同所造成，而核醣體就是蛋白質合成的位點，因此藥物只要能選擇性地作用在菌體細胞的核醣體上，就能有效地抑制菌體合成蛋白質，進而殺死菌體。而這種機轉並不會影響到人類細胞中的蛋白質合成，因為此類藥物不會作用在人類細胞的核醣體上。
細胞膜是一種由磷脂和蛋白質分子所構成的半透膜，具有選擇性通透與主動運輸兩大功能，因此對菌體而言，其重要性並不亞於細胞壁。但由於黴菌與細菌的細胞膜構造與動物細胞的結構不同，所以較易受到多烯類或多黏桿菌素類抗生素的破壞，因而影響菌體細胞膜的通透性，這是抗生素另一個抑菌的方式，一般而言，這類藥物均歸類為「細胞膜功能抑制劑」。
例如大腸菌素與多黏桿菌素類，一般是具有界面活性的物質，能選擇性地與細胞膜中的磷脂結合；而制黴菌素和安福黴素B等多烯類抗生素，可與黴菌細胞膜中的固醇類物質結合。這兩大類的藥物均能使細胞膜的通透性增加，最後因菌體內的蛋白質、核酸、胺基酸、醣化合物和離子外漏而達到殺菌的目的。
菌體的細胞壁結構強韌，能抵抗菌體內強大的逆滲透壓，因此具有保護和維持菌體正常形態的功能。由於細胞壁是微生物特有且必需的構造，因此只要能有效地抑制細胞壁合成，就能選擇性地殺死病原菌，利用這個方式抑菌的藥物包括青黴素、頭孢菌素類、萬古黴素等，而這些藥物一般歸類為「細胞壁合成抑制劑」。簡言之，這類藥物的目的就是在細胞壁上打洞，使得該處細胞膜因失去保護而破裂，最後因細胞質大量外漏而達到殺菌的目的。
雖說這類藥物都是以破壞細胞壁為目的，但更深入些來看，其實青黴素與萬古黴素的挖洞方式卻有些不同，為了探討這個差異，後續將以更深入的化學觀點來描述細胞壁的合成及此類藥物的作用機制。
聚合與交聯作用使細胞壁具高強度
菌體細胞除了許多生物代謝模式不同於人類細胞外，另一個很大的差異是菌體細胞具有「細胞壁」，而人類細胞沒有。由於菌體會利用主動運輸來濃縮溶質，使得體內的逆滲透壓高達5～20大氣壓，為了抵抗這股強大的壓力，菌體必須有個高強度的細胞壁來保護。然而，細胞壁為何具備這項特性，就必須由其結構來說明。
一般而言，革蘭氏陽性菌的細胞壁是由「N—乙醯葡萄糖胺」、「N—乙醯胞壁酸」、「短五胜肽」與「交聯胜肽」四部分所構成的，為了提供高強度的特性，菌體必須將這些構築基塊，依序串聯在一起。首先，二磷酸尿草—N—乙醯胞壁酸會依序與胺基丙酸、麩胺酸、離胺酸及一個雙胜肽（D-Ala-D-Ala）反應而生成二磷酸尿草—N—乙醯胞壁酸—五胜肽。接下來，二磷酸尿草—N—乙醯胞壁酸—五胜肽將與脂質攜帶者結合，然後再以醣酶鍵與二磷酸尿草—N—乙醯葡萄醣胺反應生成「雙醣—胜肽」，接著再經交聯胜肽鏈修飾形成「雙醣—胜肽—交聯胜肽鍵」。這「雙醣—胜肽—交聯胜肽鍵」在脂質攜帶者的幫助下穿過細胞膜，緊接著與正在成長的胜醣反應並釋放出脂質攜帶者，這個反應將增加胜醣鏈的長度。最後在肽基轉移酶的催化下，進行重要的交聯反應，而生成具高強度的網狀細胞壁。
青黴素如何在菌體細胞壁上「打洞」
乙內醯胺類抗生素是目前全球使用最廣泛的抗生素，青黴素與頭孢菌素均屬此類；在化學結構上，它們都包含一個四環的乙內醯胺環，其生物活性與這個特別的結構有關，因此某些耐藥菌會產生乙內醯胺酶來破壞這個結構，使這類藥物失去殺菌的功能。乙內醯胺類抗生素主要的功能在於阻止菌體細胞壁正常的合成步驟，使得細胞壁脆弱而失去抵抗逆滲透壓的能力，最後因菌體破裂而達到殺菌的目的。
從化學的角度來看，此類抗生素之所以具備這項能力，其原因是在細胞壁的合成過程中，包含了「聚醣鏈的增長」及「聚醣鏈的交聯」兩個重要的步驟，而這些反應必須分別在「胜醣酶」及「肽基轉移酶」的催化下才能順利進行，青黴素就是因部分結構和短五胜肽鏈中的D-Ala-D-Ala在立體結構上非常類似，因此會競爭性地抑制肽基轉移酶，使細胞壁的交聯程序受阻，進而達到殺菌的目的。
細菌抗藥性的檢驗
自青黴素應用於臨床以來，由於它神奇的治療效果，使得抗生素被廣泛使用，目前甚至有濫用的情況，因此造成經由適應性突變而產生的耐藥細菌越來越多，使得「抗生素感受性試驗」的分析愈顯重要，其主要功能是用來檢測細菌的耐藥性，或確定病原細菌對哪些藥物具有抗藥性，以提高對症下藥的保證。
一般而言，抗生素感受性試驗的定性分析結果可分為「抗藥性」、「敏感性」及「中間性」三種。若分析結果為抗藥性，表示此藥物並無法有效抑制該株細菌生長，也就是說，醫生不能按常規或以往成功的經驗進行治療，而必須選用其他的藥物；相反地，若結果為敏感性，則表示該株病原菌對此藥並無抗藥性，因此醫生可以將其當成用藥的選擇。
在抗生素感受性試驗中，「紙錠擴散法」是相當常用的一種方法。一般而言，其檢測步驟是先將待測菌液以攝氏37度的條件振盪培養隔夜，接著利用無菌棉花棒沾取菌液，並均勻塗滿培養基，然後將已塗滿待測菌液的培養盤置於抗生素紙錠分置器之下，壓下各種抗生素紙錠，最後置於攝氏37度培養室中培養，隔日以尺測量抑制環的大小來決定其為敏感性、中間性或是抗藥性。由上述紙綻擴散法的分析流程來看，其特點是方便、易操作；且測定的藥物隨意可變，靈活性強；最重要的是紙綻擴散法有一套完善的品質控制方法，其結果可靠。
抗萬古黴素腸球菌的種類
在利魯唑（Synercid）與采福適（Zyvox）這兩款新藥臨床應用以前，「萬古黴素」一直是抗菌藥物的最後一道防線，素有「銀色子彈」的美名。由於近年來人類大量的使用，已陸續發現抗萬古黴素腸球菌（VRE）及抗萬古黴素金黃色葡萄球菌（VRSA），並引起專家學者、醫療人員及大眾的高度關切及研究，期能求得解決的方案。
在一些對萬古黴素具抗藥性的細菌研究中，抗萬古黴素腸球菌可說是被系統化研究最為透徹的，一般根據其對萬古黴素及壁黴素的抗藥能力，而區分為vanA、vanB及vanC三種菌株。
「vanA菌」是從屎腸球菌、糞腸球菌中分離出來的，一般而言，它們對萬古黴素及壁黴素都具有高度抗藥性。從生化的角度來看，vanA型菌株的抗藥性基因是位於質體上，它可經由接合作用將含有抗藥性的基因傳遞到另一株細菌內，而這種傳遞方式亦可能發生在不同的菌種間，因而導致抗藥性的擴散與蔓延，這也是近幾年抗萬古黴素金黃色葡萄球菌（VRSA）激增的原因之一。
「vanB菌」可從屎腸球菌、糞腸球菌、母雞腸球菌中分離出來，其抗藥性基因是位於細菌的染色體上，雖然它的傳遞頻率較vanA型菌株低，但依然可經由接合作用將含有抗藥性的基因片段傳遞到另一株細菌上。一般而言，vanB型菌株對萬古黴素具有中度抗藥性，而對壁黴素則為感受性。
「vanC菌」是從母雞腸球菌、酪黃腸球菌中分離出來的，其抗藥性基因所在的位置與vanB型菌株相同，都是位於細菌的染色體上，但該段基因不具有傳遞性。一般而言，vanC型菌株對萬古黴素呈低度抗藥性，而對壁黴素則為感受性。
抗萬古黴素腸球菌如何對抗萬古黴素
一般來說，萬古黴素主要是用來殺害像腸球菌、鏈球菌及葡萄球菌這類革蘭氏陽性菌的抗生素，但對革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）則比較無效，其主要原因是革蘭氏陰性菌在細胞壁外尚有一層外膜，它會阻礙萬古黴素直接與細胞壁前質結合，因此革蘭氏陰性菌天生就對萬古黴素具有很高的抵抗力。
萬古黴素類似杯形的分子結構與細胞壁前質末端的D-Ala-D-Ala在立體上有很好的契合，並以五個氫鍵呈現結合的專一性，使得萬古黴素易於跟細胞壁前質末端的D-Ala-D-Ala結合，因而阻止細胞壁前質加到正在成長的胜醣上，並使得後續的轉醣酶與肽基轉移酶無法繼續作用。經由上述一連串的抑制動作，使得新生的細胞壁鬆散而無法抵抗菌體內強大的逆滲透壓，最後導致菌體破裂而達到殺菌目的。
雖然萬古黴素巧妙地抑制細胞壁成長而達到殺菌的目的，但細菌並未因此而絕跡，由於其適應性的突變能力，為它們自己打造了一套抗藥的機制。例如抗萬古黴素腸球菌就將原來細胞壁前質末端的D-Ala-D-Ala改造成D-Ala-D-Lac，這種新型的細胞壁結構，使萬古黴素對其親合力下降達一千倍之多。也就是說，萬古黴素將無法有效地抑制轉醣酶與肽基轉移酶的作用，使新生細胞壁在萬古黴素存在的狀況下，依然能有效地增長與交聯，最後導致「抗萬古黴素腸球菌」對萬古黴素具有強大的抗藥性。
