人類的好伙伴–昆蟲桿狀病毒：基因工程時代的抗疫英雄
100/08/03
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吳宗遠｜
中原大學生物科技系
醫學史上最偉大的成就之一就是消滅天花。天花是由人類痘病毒造成的可怕傳染性疾病，致死率可達35％，僅在20世紀就約有3億人死於天花。如此可怕的病毒之所以能被消滅，倚靠的不是抗生素（抗生素通常是用來對付細菌），而是疫苗「vaccine」（音似臺語的「不會死」），vaccine的原意是接種牛痘。消滅天花病毒的大業起於1796年，英國的金納醫生（Edward Jenner）以牛痘做為「vaccine」—疫苗，直到1977年世界衛生組織宣布天花絕跡，歷時約180年。
在這漫長的歲月中，人類對疫苗的認識愈來愈多，也見識到微生物（包含許多可怕會致病的細菌和病毒）生存的本事。若沒有好的疫苗讓身體產生免疫力來對抗這些病源，人類的生命也許會有如風中殘燭般充滿危機。
自從巴斯德成功研製出狂犬疫苗後，許多危害人類甚巨的疾病，諸如百日咳、白喉、破傷風、麻疹，小兒麻痺、肺結核等，都有很好的疫苗當武器，使我們得以健康快樂地生活著。當然，我們的寵物貓、狗或做為食物的雞、豬、牛、羊等，也需要疫苗的保護才能安然無恙地活在微生物的攻擊之下。因此，近代公共衛生的建立及畜牧業的發展，實有賴疫苗的開發。
要怎麼製造疫苗呢？早期消滅天花的疫苗是把牛痘病毒接種在牛腿上，以生產大量的牛痘疫苗；對付小兒麻痺的疫苗生產自猴子的腎臟細胞；每年施打的流感疫苗則是以雞蛋培養而來。但是這些古典的疫苗製作技術都要先繁殖大量有致病性的病毒，總有不確定的風險。可喜的是1970初開始蓬勃發展的基因工程，提供了另一安全、便利的疫苗生產捷徑。
理論上，只要能生產抗原（通常是細菌或病毒上的特殊蛋白），並把它打入動物或人體內，身體的免疫系統若因此能產生保護效果（如產生具保護力的抗體）並建立免疫記憶性，這抗原就可做為疫苗。桿狀病毒表現系統是建立在昆蟲細胞中的重組蛋白生產系統，在疫苗的生產上可能非常有用，是未來的抗疫英雄。讓我們來了解什麼是桿狀病毒，以及桿狀病毒在疫苗開發方面的成效。
桿狀病毒
桿狀病毒是一群會感染節肢動物，具有被膜的雙股DNA病毒。絕大多數桿狀病毒的宿主是昆蟲，包括鱗翅目、膜翅目、雙翅目等六百多種昆蟲。桿狀病毒最早的紀錄是生產蠶絲時受其感染的「昆蟲病」，後來卻以其能防治「蟲害」的觀點進行許多昆蟲病理學研究。因分子生物學的引入，除進一步了解其病毒學的基礎研究外，更發展出桿狀病毒重組蛋白的生產系統，並做為基因療法的載具。
今日，桿狀病毒不但在學術研究單位的實驗室中做為生產重組蛋白的基礎工具，也是生物農藥研發的重點，或做為哺乳動物的基因載具，同時是許多工業製藥界生產疫苗、蛋白質藥物的生產工具。因此在美國衛生研究院論文資料庫（PubMed）內已累積上萬篇的論文，在歐盟的專利資料庫中也登記了上千筆的專利發明。
桿狀病毒早期是藉由其在宿主內繁殖後會產生多角形或顆粒狀的包含體來分類，因此分為核多角體病毒屬（nucleopolyhedrovirus, NPV）和顆粒病毒屬（granulovirus, GV）。其中NPV又可依其包含體中被膜內的病毒鞘數，再區分為僅含單一病毒鞘的SNPV和含多個病毒鞘的MNPV。
然而隨著分子生物的進展，在更多的桿狀病毒基因體被解序後（於2008年已有41種桿狀病毒被解碼），新的桿狀病毒分類是：能感染鱗翅目的NPV—α-baculovirus，GV則是β-baculovirus；感染膜翅目的NPV—γ-baculovirus；感染雙翅目的NPV—δ-baculovirus。其中α-baculovirus又可分為group I NPV和group II NPV。
表現載體
在過去的20年間，桿狀病毒表現系統是廣為使用的真核表現系統之一。自從史密斯（Smith）等人於1983年成功地以加州苜蓿夜蛾核多角體病毒做為表現載體，在昆蟲細胞中表現具生物活性的β－干擾素後，已有上千種以上的蛋白質成功地以桿狀病毒表現系統生產。可以生產大量的外源蛋白，是桿狀病毒表現系統廣為使用的原因之一。
每個受桿狀病毒感染的昆蟲細胞，於感染後的3∼5天，細胞內約可累積30∼50％桿狀病毒的包含體蛋白或分子量10 kDa的纖維蛋白P10。而這兩高表現的基因在細胞培養條件下，對於病毒的增殖並非必需，因此欲生產外源蛋白時，通常把蛋白基因先選殖進桿狀病毒的轉移載體，再利用同源重組的方式以這基因置換polyhedrin gene或p10 gene，而以強效啟動子polyhedrin promoter或p10 promoter進行外源基因的表達。當利用細胞培養方式生產時，通常每公升培養液的重組蛋白產量可達1∼500mg。
除了產量高以外，相較於細菌或酵母菌等表現系統，桿狀病毒還有下列優點：
後轉譯修飾作用，如磷酸化、醣基化等，較細菌或酵母菌表現系統更接近高等真核生物；可提供較佳的蛋白質摺疊環境，而不會產生不溶體，不需要繁複的蛋白質還原程序就能獲得具生物活性的重組蛋白；桿狀病毒是環狀DNA病毒，可以攜帶較大的DNA片段；受桿狀病毒感染的昆蟲細胞仍能執行內含子剪接的功能，可生產由哺乳動物基因庫選殖出的基因；相對於哺乳動物細胞，昆蟲細胞較易培養，例如不需要二氧化碳和對溫度變化有較大的耐受性；操作簡易快速，不若基因轉殖動物或植物需要較長的時間才可能生產重組蛋白。
生產抗原做為疫苗
桿狀病毒除了用來生產如干擾素等醫療用蛋白外，也是極佳的次單位疫苗生產工具。以桿狀病毒生產次單位疫苗較以大腸桿菌生產次單位疫苗的優勢，在於不會有易引起過敏或休克的外毒素或脂多醣體，也沒有酵母菌可能有甲醇殘存的風險。因此在發酵製程上，桿狀病毒昆蟲細胞表現系統雖然無法和單細胞的大腸桿菌或酵母菌匹敵，卻已廣泛應用在疫苗的開發研究上，例如用來生產HIV gp160、gp24的抗愛滋疫苗。其中最受矚目的，應屬美國的蛋白質科學生物科技公司的人類流感疫苗—FluBlØKTM。
關於流感疫苗的製造，一般都由世界衛生組織和美國疾病管制局預測隔年可能會大流行的3株人類流感病毒株，再以雞胚製成三價疫苗。蛋白質科學生物科技公司以桿狀病毒昆蟲表現系統，生產出人類的流感三價疫苗是一大突破。若以雞胚進行流感疫苗的生產，在病毒株的選殖上要在雞胚中能大量繁殖且保有保護性抗原，是一大挑戰。
桿狀病毒表現系統則無這困難，只要完成流感抗原基因的選殖，製作出含有流感基因的重組桿狀病毒，以雞胚生產流感疫苗時所遭遇的困難就可以昆蟲細胞迎刃而解。在1997年，香港爆發高致命性的H5N1禽流感疫情時，在美國國家衛生研究院的協助下，蛋白質科學生物科技公司於短短8周內，就成功地以桿狀病毒表現系統製備急需的H5N1禽流感疫苗。
除了生產人類疫苗外，桿狀病毒表現系統也可用來生產動物用的次單位疫苗。例如拜耳公司所推出可以防治豬瘟病毒的BayovacCSFE2TM，就是以桿狀病毒在昆蟲細胞中生產出豬瘟病毒的重組E2蛋白所製成的次單位疫苗。除此之外，針對另一種豬隻常見的第二型豬環狀病毒，德國的百靈家就是以桿狀病毒表現系統生產ORF2蛋白製成疫苗—Ingelvac®，以防治許多仔豬的疾病。
生產類病毒顆粒做為疫苗
欲成為一個好的疫苗，除了要有「招搖」的抗原決定部位外，和病毒長得愈像愈好。就病毒疾病的疫苗而言，類病毒顆粒（virus likeparticle, VLP）的外表就和感染性的病毒一模一樣，但VLP卻無感染性，因為它僅披有病毒外殼，卻沒有病毒的基因體。因此若欲發展安全又有效的疫苗，類病毒顆粒是最佳的選擇。例如，利用酵母菌表現系統製成的B型肝炎病毒疫苗，如默克藥廠的Recombivax HB®或葛蘭素史密斯克林藥廠的Engerix B®，就是製造成重組的B型肝炎病毒類病毒顆粒。
最近剛上市的子宮頸癌疫苗Gardasil®，則是默克藥廠以酵母菌生產人類乳突病毒的類病毒粒子所製成的。在這個「戰場」上，桿狀病毒也沒有缺席。以子宮頸癌為例，葛蘭素史密斯克林藥廠就是以桿狀病毒表現系統，分別生產出HPV第16型和第18型的類病毒顆粒做為疫苗，上市的商品名是CervarixTM。
上述的類病毒顆粒疫苗中，不論是B型肝炎病毒疫苗或人類乳突病毒疫苗，組成都較單純，僅含一種蛋白分子，如B型肝炎病毒表面抗原或人類乳突病毒的L1蛋白，因此也可以利用酵母菌進行類病毒顆粒的生產。若是較複雜的類病毒顆粒，如輪狀病毒，欲製備其類病毒顆粒，則必須表現輪狀病毒的VP2、VP6、VP4、VP7等4種蛋白才可製成。
因桿狀病毒可重組進大小約3萬8千個鹼基對（38 kbp）的DNA片段，因此適合用來做為生產類病毒疫苗的表現載體。例如以桿狀病毒同時生產流感病毒的HA、NA和M1病毒的流感類病毒疫苗，已在動物測試中獲得很好的免疫保護效果。由新竹清華大學化工系胡育誠教授領導的團隊，也以桿狀病毒表現系統成功製備出腸病毒71型的VP1、VP3和VP0所組成的類病毒顆粒，在小鼠的動物實驗中，證實有很好的疫苗保護效果。
為有效利用桿狀病毒於昆蟲細胞中，同時產出多種的病毒蛋白以組成類病毒顆粒，多效型桿狀病毒表現系統的開發是很有利的工具。1993年，英國的羅依（Roy）教授首先開發出含多個啟動子的桿狀病毒表現載體，在昆蟲細胞中製備出含有牛藍舌病毒的VP2、VP3、VP5和VP7的類病毒顆粒。
最近臺灣大學昆蟲系王重雄教授和筆者的研究團隊，成功地把臺灣榕樹透翅毒蛾病毒上的核醣體內轉譯子引進桿狀病毒表現系統中。利用核醣體內轉譯子，桿狀病毒表現系統可在單一啟動子的控制下，利用轉錄出的mRNA分子上可形成特殊結構的核醣體內轉譯子，於轉譯時產出兩種不同的蛋白，這技術有利於發展桿狀病毒表現系統做為類病毒顆粒疫苗生產的平臺技術。利用這技巧可以僅以一重組桿狀病毒同時生產輪狀病毒的VP2和VP6蛋白，組裝成雙層的輪狀病毒類病毒顆粒，而不必大費周章地生產兩隻分別帶有VP2和VP6蛋白基因的重組桿狀病毒，使製程節省約一半的時間和成本。
桿狀病毒做為疫苗生產的「工作馬」（workinghorse），不論是單純的抗原次單位疫苗或是類病毒粒子，都已成為成熟的平臺，是人類健康的守護英雄，也是家畜、禽的抗疫英雄。除此之外，桿狀病毒雖是一種源自昆蟲的外源蛋白表現系統，但可以有效率地做為哺乳動物細胞的基因載具。開發桿狀病毒做為疫苗載具是未來重要的研究方向，也期待有志之士投入這一新興的領域。
