受傷DNA修復的觀察

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受傷DNA修復的觀察

95/06/07 14329

朱淑芬｜清華大學分子醫學研究所

劉銀樟｜清華大學分子醫學研究所

看到細胞修復的過程

由於臭氧層的破壞日趨嚴重，人類受日光中紫外線照射的機率也隨著增加。紫外線會傷害細胞內的去氧核醣核酸（DNA），若不加以修護，可能導致基因突變或癌症的發生。幸好人類細胞有一套修復機制，可修復這種因紫外線照射所造成的DNA傷害。最近有一項漸受研究者採用的實驗技術－微孔紫外線照射（micropore UV irradiation），這項實驗技術配合一般免疫螢光染色法，便可以觀察修復機制在細胞中運作的情形。

微孔紫外線照射技術最初是由日本森俊雄（Toshio Mori）博士及其同仁於2001年提出的（J. Invest. Dermatol. 117 （2001）1156-1161），他們利用實驗室常用的濾膜（平時用來過濾分子或細菌）做為濾鏡，讓紫外線只能穿過3～5微米（μm）的孔洞，使得被照細胞的DNA只有局部受傷，再輔以傳統的免疫螢光染色，就可以觀察到不同時間及空間下活細胞DNA受傷後的修補過程。

細胞的自我修復機制

過度曝曬紫外線除了造成皮膚變黑與老化之外，也可能導致基因突變或細胞癌化。當細胞受到短波長紫外線照射後，會產生兩種主要的DNA傷害，即環丁嘧啶二聚體（簡稱CPD）和嘧啶6－4二聚體（簡稱6－4PP），這二者都是DNA分子鹼基（嘧啶）間異常的鍵結物。

細胞中有一套修復機制，即核酸切割修補（nucleotide excision repair，簡稱NER），能夠修復這些DNA傷害。NER是一種由一系列修復蛋白質所參與的機制，當DNA傷害產生後，修復蛋白便會前去辨識，再經由切除、填補、黏合等步驟完成修復。

幫助細胞修復

在人群中有些人帶著體隱性遺傳疾病，例如色素性乾皮症（Xeroderma Pigmentosum，簡稱XP），由於缺乏某種正常的NER基因，無法像正常人一樣修復這些DNA傷害，因此他們對光照非常敏感。這些XP病患除了有皮膚癌高罹患率的顧慮外，也容易有其他體內器官癌變的隱憂。過去學者在研究細胞中的DNA修復機制時，由於傷害範圍太大無法清楚觀察細胞的修復運作，現在因為有微孔紫外線照射技術，上述的困擾就得以解決。

我們可以藉由這種技術，僅允許部分紫外線從濾膜上的小孔洞穿過，把DNA傷害局限在核的某一小區域，以便觀察修復蛋白集合到傷害區域的情形。藉上述方法對細胞進行微孔紫外線照射之後，移除濾膜讓細胞修護一段時間，再利用可以辨識CPD或6－4PP的抗體，或者是修復蛋白的抗體進行免疫螢光染色，以便觀察DNA損壞與修復蛋白共位（co-localization）的情形。

免疫螢光染色法是先以專一性高的一級抗體來辨識標的物，再給予帶有螢光的二級抗體來辨識一級抗體，如此，經由觀察螢光顯微鏡所看到的螢光訊號，便可以找到標的物的位置。

DNA修復過程的實例

以人類纖維母細胞MSU－1為實驗材料，在薄膜覆蓋下進行微孔紫外線照射（波長254奈米，能量密度是100焦耳／平方公尺），30分鐘後，利用CPD抗體和修復蛋白XPB抗體進行螢光染色。XPB具有核酸解旋瓷活性，在NER過程中負責解開DNA雙股螺旋以利切除傷害的部位。

首先對某一視野的所有細胞核以DAPI染色，DAPI是一種有機小分子，可以插入雙股DNA的溝槽中形成DNA－DAPI複合物，由於它會吸收特定波長而釋放藍色螢光，因此可用來確定DNA的位置。接著在同一視野內以CPD抗體螢光染色，因其二級抗體帶有釋放紅色螢光的探針，所以訊號是紅色。當部分細胞核內含紅色顆粒狀螢光訊號時，就表示細胞核受到局部傷害。

在同一視野內再以XPB抗體螢光染色，因其二級抗體帶有釋放綠色螢光的探針，所以它的訊號是綠色，受傷部分的細胞核內會呈現顆粒狀綠色訊號。把利用CPD染色的照片與利用XPB染色的照片重疊，照片上的綠色訊號和紅色訊號恰好在同一位置，表示XPB和CPD的位置是一致的，因此可知MSU－1細胞經紫外線照射後，隔30分鐘就有修復蛋白XPB到DNA損害處進行修復。

以中國倉鼠卵巢細胞CHO－KI及帶有NER缺陷的同源細胞株UV24做為實驗材料，進行紫外線局部照射。這二種實驗材料經紫外線照射後，立刻用6－4PP抗體進行免疫螢光染色，可以看到細胞受到局部傷害的訊號。若讓細胞經過9小時的修復，便已無法在CHO－KI中偵測到6－4PP的訊號。然而以同樣方式處理UV24細胞，6－4PP的螢光訊號仍然存在，顯示CHO－KI在這段時間可以完全修復細胞的6－4PP傷害，UV24細胞則不能。

眼見為憑

我們常說「眼見為憑」，紫外線局部照射加上免疫螢光染色的研究技術，似乎可以替這句成語作註解。新技術協助我們對格物致知的真理追求，真正「看見」DNA損傷與修復的過程。

上述的兩個實驗只是當作例子說明，這項新技術的應用當然不只是如此。另一方面值得一提的是，NER除了修補因短波紫外線造成的DNA損傷外，也負責修補其他許多化學物質如吸菸、油煙、藥物所造成的DNA損傷，因此核酸切割修補的效率與我們健康息息相關，不單只是對付紫外線曝曬的問題而已。

資料來源

《科學發展》2006年6月，402期，48 ~ 51頁

科發月刊(5221)

受傷DNA修復的觀察

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