畜產生物科技：複製牛羊|

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畜產生物科技：複製牛羊

92/12/10 14684

曲鳳翔｜行政院農業委員會畜產試驗所

複製與核轉置

複製源自於希臘語「klon」，本意為「小枝」，是指利用插條繁殖出完全相同的植物，亦指製造出基因組成完全相同的動物體群。因此，生物界複製的實例早已發生在很久以前。例如，經由葉片或插枝壓條即可繁衍後代的植物，或經橫切後即可成長為兩隻完整個體的蚯蚓等。

高等哺乳動物的複製卻不是簡單地將個體分切即可完成，而必須應用更精密的顯微手術。在複製科技研究的萌芽期，其目的在探討早期胚中單一胚葉細胞的發育能力。結果證實發育至四細胞期前的單一胚葉細胞，具有發育成一生命體的能力，但後期的單一胚葉細胞則無此潛能，更遑論期待僅由一個體細胞複製出一個體。此等限制，一直到核轉置技術建立後才被克服。

核轉置技術乃期望藉由卵母細胞的孕育，使經注入處理的卵母細胞的細胞發育能回溯到受精卵階段，以突破細胞發育歷程中的不可逆現象。其步驟是先去除卵母細胞的核及第一極體，再將單一的供核細胞置入受核卵母細胞的卵膜間隙，並施以細胞融合及激活處理；隨後，再將發育的複製胚移置入性周期同步化的代理孕母生殖道內，以產出基因轉殖胎兒。

因此，動物複製技術實應稱之為核轉置或核移植技術。既然複製胚係由一供核細胞與卵所組合成的，其遺傳物質便是由供核細胞所提供的體基因組，和由卵細胞質所提供的粒線體去氧核醣核酸（DNA）所組成。所產製的核轉置動物，其體內每一細胞的遺傳物質皆含上述兩種來源的DNA；若進一步比較每一細胞內體基因組DNA與粒線體DNA的比例，可發現體基因組DNA的含量大於99.9％。因此，迄今所出生的複製動物雖未達百分之百的複製，卻也極為接近了。

以現今的技術到底有沒有可能產製出100％的複製動物呢？答案是肯定的，也就是使用自己的卵及體細胞當材料就可達成。但因僅雌性動物才有卵可提供，且每一雌性動物可提供的卵源有限，因此成功機率更低，所以到目前為止，世界上仍未有100％複製的動物產出紀錄；至於雄性動物，由於自身無卵提供，也就沒有100％複製的條件。

複製胚產製過程

如上所述，動物複製胚產製過程，主要包括受核卵母細胞的去核操作、細胞注入卵的顯微操作、受核卵母細胞與注入細胞的細胞融合以及融合細胞的激活處理等四項技術。

複製動物所使用的細胞核來源，主要有已分化的細胞和未分化的胚葉細胞或胚幹細胞。已分化細胞經增生後仍維持其原有的細胞特性，如皮膚細胞只能增生為皮膚細胞，肝臟細胞也僅能增生成肝臟細胞；換言之，已分化細胞的後續發育命運，無法回溯到如早期胚般具有發育成完整個體的全能性。未分化的胚葉細胞或胚幹細胞，雖具有發育成個體中各類細胞的能力，惟截至目前為止，僅見四細胞期以前的早期胚的單一胚葉細胞，有發育成完整個體的紀錄，而八細胞期以上的仍無成功的案例；顯見此等單一未分化細胞，發育成個體的潛能仍局限於甚早的胚期，但若將這些未分化或已分化的單一細胞，注入卵母細胞，則可改變其命運使之有能力發育成一完整生命體。

哺乳動物的複製並非僅靠一個細胞即可達成，此一細胞必須借助卵母細胞內所含發軔因子，將基因組再程序化作用後，始具有發育能力。然因卵母細胞內原已擁有雙套的染色體，若不加以去除，它與注入含兩套染色體的體細胞融合後，將形成四套染色體的異常現象。因此，首要步驟是先將卵母細胞內的雙套染色體去除，其後，再利用顯微操作技術，將含有正常兩套染色體的單一細胞注入卵內。

當精子穿入卵透明帶與卵細胞膜接觸後，即產生自發性的融合現象，以促使精子細胞核進入卵內，而完成受精作用，這是自然的精卵受精過程。然而，複製胚產製過程中，供核細胞在注入卵膜間隙後，供－受核細胞間無法自發性發生如精卵接觸後的融合現象，而必須藉由外力迫使其融合。利用電刺激可促使細胞融合，乃因細胞經電激處理後，細胞膜表面會形成約0.5奈米的小孔，經證實，此小孔即為導引兩細胞發生融合的媒介。

大多數哺乳動物的卵母細胞在排卵時，其細胞周期乃靜休於第二次減數分裂中期。正常授精情況下，精子表面與卵母細胞貼附時，在接觸位置引發卵母細胞內鈣離子濃度的增加，並在3～6秒的時間內，迅速擴及整個細胞，引導卵母細胞產生皮質顆粒胞泌作用，防止多精入卵。隨後，細胞內鈣離子濃度呈現周期性增加，並持續數小時，進而激活卵母細胞，使其恢復第二次減數分裂。

體細胞複製時，雖供核細胞已融入卵母細胞內，但供核細胞融入後，並無法激發如精卵融合後所產生的激活機制，因而需要以人為激活方式，模仿精子激活卵母細胞。利用電刺激或酒精，增加卵母細胞內鈣離子的濃度，或直接以化學試劑抑制細胞靜止因子的活性，均可激活卵母細胞。

複製牛羊

動物複製成功的比率平均只有1～8％，即使懷孕後能順利分娩，新生胎兒出現肺臟、心臟、泌尿系統及免疫系統等缺陷而早期夭折的比例偏高。這些現象目前尚無法克服，因此產製複製動物時，需要充足的試驗材料，如大量的卵子、代理孕母以及純熟的人工生殖技術，才能得到少數健康的複製個體。

要成功複製動物，胚體外生產、胚移置等生殖技術必須密切配合。卵母細胞在經過核轉置顯微操作之後，複製胚才能夠順利地在體外培養至囊胚期，並移置到同期化的代理孕母生殖道中著床發育。在這些關鍵技術的結合之下，台灣第一頭以卵丘細胞為供核源的複製牛「畜寶」在二○○一年九月一日剖腹誕生；同年十二月進行以耳細胞為供核源複製阿爾拜因乳羊計畫，二○○二年七月五日經由自然分娩，產下兩頭複製羔羊，取名為「寶吉」與「寶祥」。這兩頭複製乳羊出生至今已滿周歲，活潑健康，並已有正常發情現象，當生殖季節來臨時，將予以配種繁殖以完成傳宗接代的使命。

從複製胚發育缺失及新生複製胎兒缺陷做深入探討，發現複製胚中有許多基因的表現異常，這些表現異常基因的功能多數跟胚早期發育及胎盤形成有關，以致胎兒的臍帶因胎盤發育不全而產生代償性生長，普遍有異常肥大的現象。這些特殊基因的表現係受到牠們的父母產生配子時特別留下的「印記」所影響。

複製胚胎因為沒經過這種配子形成的過程，而造成這些基因的印記和正常胚胎的圖樣有所不同。據推測，DNA甲基化可能是調控這種特別「印記」的主要原因之一。正常的DNA有一定的甲基化特徵，基因的表達可藉由DNA甲基化而受到調節。當正常的受精胚發育到囊胚時，大多數的甲基（CH3）已經被去除。然而，經由細胞核轉置技術產生的複製胚，卻仍然在某些DNA部位有甲基化的存在，並且在胚胎發育的過程中，這些甲基一直未被去除。根據複製胚異常現象所衍生的研究，可以解開許多生命現象的疑點，而從這些方向做深入的探討，更是提升複製效率的不二法門。

複製技術的研發，可作為探究生命起源的基礎。複製胚能發育成完整的個體，證明了兩件事：第一，成熟個體的體細胞雖經過多次的細胞分裂與分化，但每一個細胞的染色體中還是擁有完整的生命遺傳訊息；第二，卵母細胞中含有特殊的因子，它可以讓遺傳密碼的表現回到起點，按照編好的程序重新演繹一個新的生命。

核轉置科技的應用，除可在胚胎發生學領域中，用來評估供核細胞的發育全能性外，亦可用於探討源自父方或母方基因組，在胚胎早期發育過程中所扮演的角色，以及細胞質粒線體DNA與細胞核內DNA，兩種遺傳物質間的交互作用。

在實際應用上，複製技術可以用來大量擴增優良家畜族群，也可應用在瀕臨絕種或是已經絕種動物的復育工作；若再與細胞基因轉染技術結合後，可用來產製基因轉殖家畜，並建立生產人類醫用蛋白質的生物工廠。此外，也可用於人類胚幹細胞的研究，以生產個人專屬的胚幹細胞庫，提供基因治療或器官移植所需的細胞來源。當世界科技已邁入分子生物科技之際，核轉置技術必將扮演關鍵角色。

資料來源

《科學發展》2003年12月，372期，12 ~ 17頁

器官移植(12) 科發月刊(5221)

畜產生物科技：複製牛羊

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