微生物農藥：桿狀病毒的應用
98/11/04
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王重雄｜
臺灣大學動物學研究所
葉斯佳｜
臺灣大學動物學研究所
疾病是所有生物體必須面對的問題，通常在生物體對環境變化的調控能力下降時發生。除了物理性的傷害外，感染性病原體的入侵也是主因，這些病原體包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲等。毫不起眼的昆蟲，同樣會遭受這些病原體感染而罹病，也常有季節性或周期性的流行疫病發生。引發流行疫病的昆蟲病原體稱為微生物天敵，這些微生物天敵常是昆蟲自然族群消長和調控的因子。這些微生物天敵的利用不只可抑制害蟲，降低牠們對經濟作物和森林的危害，還可以減少化學農藥的使用。
已利用做為防治害蟲的昆蟲病原體，包括桿狀病毒、蘇力菌、白殭菌、綠殭菌、黑殭菌、蟲生線蟲等。本文僅就桿狀病毒的背景、潛力和應用簡介如下。
基礎生物學
桿狀病毒科是無脊椎動物病毒中的最大科，這種病毒僅會感染無脊椎動物，目前尚未發現感染脊椎動物的病例。這一科包含 2 屬：核多角體病毒和顆粒體病毒。桿狀病毒的最大特徵，是在被感染的細胞核內會形成數目不等的結晶狀體，即封埋體。封埋體內包埋著由一層被膜包裹著一個或多個核蛋白質鞘的病毒粒子，稱為封埋性病毒。
被核多角體病毒（或顆粒體病毒）感染而罹患核多角體病（或顆粒體病）的末期病蟲，常有往上攀爬並倒懸於樹枝而死的現象。此外，病蟲體內的器官和構造會液化，體液內充滿著游離狀的封埋體，表皮脆弱一觸即破，流出含大量封埋體的濃汁（早期因這種病徵而稱為黃疸病），這有助於封埋體的散布。昆蟲核多角體病的流行常有季節性，因此被認為是調控昆蟲族群的主要方法之一。
生活史和致病機制
昆蟲取食受到封埋體污染的食物後，封埋體便隨食物進入昆蟲的中腸。昆蟲的中腸有別於人類的胃（胃液的 pH～2），是一個強鹼的環境（pH～10）。封埋體內的蛋白酵素會在強鹼性的環境中活化（無法在人類的酸性胃液中活化），因此昆蟲桿狀病毒是不可能感染具有強酸胃液的人類或脊椎動物。
當蛋白酵素活化後，會分解結晶狀的核多角體蛋白（或顆粒體蛋白），而釋出封埋性病毒。穿越過圍食膜（圍食膜位於昆蟲中腸內，它的功能是使食物局限在特定區域，以使消化酵素分解食物，和抵擋外來病原體進入昆蟲體內）後，封埋性病毒的被膜和中腸細胞的細胞膜融合，核蛋白質鞘就被釋入細胞內。在核蛋白質鞘進入細胞核之前會先退鞘，退鞘是鞘蛋白在胞質內被分解而裸露出病毒 DNA，之後病毒的 DNA 就進入核內進行基因複製和病毒增殖。
病毒進入昆蟲細胞核後，首先會形成病毒形成團，約位在細胞核的中央。這是一個病毒組裝和製造的工廠，組合並生產許多核蛋白質鞘，這些核蛋白質鞘會以出芽方式離開感染的細胞，這種病毒稱為胞外病毒。在感染初期，胞外病毒會被大量生產，這些病毒離開感染的中腸細胞後，通過中腸細胞下的基底板進入昆蟲血液，隨著昆蟲血液在血體腔內循環，而散布於昆蟲體內各器官和組織的細胞中。
病毒感染至末期（從感染開始約 18 小時後），封埋體蛋白（或顆粒體蛋白）就開始在細胞膜內製造。當這蛋白進入細胞核後，核內蛋白質便大增而逐漸形成結晶體。之後，病毒形成團內的大量病毒粒子，會被封埋體蛋白（或顆粒體蛋白）包裹住，成熟的封埋體（或顆粒體）的表面會再被一層醣組成的被膜覆蓋。感染細胞最後會崩解，封埋體（或顆粒體）就釋入昆蟲體腔內。罹病昆蟲的蟲體崩解後，封埋體（或顆粒體）就散布在環境中，待其他昆蟲食入後，便進入另一個複製周期（或稱感染周期）。
昆蟲桿狀病毒病的研究史
早在西元 1527 年，就有家蠶黃疸病的描述。西元 1856 年，義大利科學家 Maestri 和 Cornelia 首次釐清，家蠶黃疸病和罹病家蠶體內出現折射性結晶體（病毒的封埋體）的因果關係。
1947 年，Bergold 指出這種結晶體有桿狀病毒的特性。在二次世界大戰後，桿狀病毒的研究著重在重要經濟害蟲防治應用的可行性上。在 1950 ~ 1960年，確定桿狀病毒可做為病毒性殺蟲劑。但隨著化學工業的蓬勃發展，合成殺蟲劑以便宜、毒殺對象廣、高殺蟲效果等好處成為主流的殺蟲劑，造成病毒殺蟲劑未能被進一步研究和商品化。
1970 ~ 1980 年間，由於過度使用化學殺蟲劑，許多農業、環境生態和人體健康的問題接著產生，再加上新化學藥劑的開發困難及人們觀念的改變，無毒和有機農業因而興起，促使病毒殺蟲劑再次受到重視。
應用於生物防治上的優缺點
在1973年，世界衛生組織—聯合國糧農組織—公布桿狀病毒可安全使用於害蟲防治。
它在生物防治上的優點有：寄主域狹窄——僅對某些標的昆蟲有感染力，對其他益蟲（例如蜜蜂）和天敵毫無毒性，對脊椎動物也是絕對安全的；效果佳——在田間施用時能造成害蟲個體間的相互傳染（水平傳播），有些封埋體更能在土壤中繼續維持感染力多年，伺機等待害蟲食入，再次造成害蟲的大量死亡；方便性——使用方法簡單，無需特殊器械，僅用一般噴藥工具就可噴灑施放；相容性——可和化學農藥或其他微生物混合搭配使用，以防治其他病蟲害。
雖然桿狀病毒具有以上優點，然而施用多年後，仍然無法和化學藥劑匹敵。
事實上，以桿狀病毒防治害蟲仍有亟待克服的問題。例如殺蟲時間長，若以化學藥劑殺蟲僅需二至三天就能見效，但桿狀病毒需一個星期左右才能殺死害蟲；環境因子干擾病毒殺蟲效果，病毒是一種微生物，活力易被環境因子影響，尤其紫外線和乾燥；大量生產困難，昆蟲病毒是細胞內寄生的病原體（增殖、複製都需在活體的寄主體內），因此生產病毒前，須先大量飼養寄主昆蟲或培養昆蟲細胞，不僅耗時、耗力，且需有大量經費投入，在生產成本上無法和化學藥劑競爭。
成功案例
病毒微生物首先用於森林害蟲防治。在 1960 年代松毛蟲大量發生，把松葉啃食殆盡，經林務局和當時的農復會引進質多角體病毒（是一個可形成封埋體的 RNA 昆蟲病毒），配合其他的微生物殺蟲劑施用，成效顯著，也使松毛蟲從此銷聲匿跡。
病毒微生物不僅在森林害蟲防治上有不錯的成果，也運用在蔬菜害蟲防治上，甜菜夜蛾核多角體病毒是防治青蔥上害蟲甜菜夜蛾的成功案例。
青蔥是宜蘭地區的一種重要作物，每年的 5 到 9 月是甜菜夜蛾大發生的時間，成蟲產卵於青蔥葉尖。從卵中孵化出來的幼蟲有群聚性，但二齡幼蟲開始分散取食，二到三齡幼蟲鑽入蔥管內取食葉肉，使蔥管僅剩外表皮。至四到五齡食量大增，使整欉蔥管產生孔洞，且可發現多隻幼蟲危害同一蔥管，嚴重時取食殆盡。甜菜夜蛾核多角體病毒首次從埔里地區滿天星植栽上的甜菜夜蛾的病蟲體內分離出來，之後經由農業藥物毒物試驗所（藥毒所）實驗室的測試，發現對甜菜夜蛾有極高的致病性。
在 1989 到 1991 年間，在宜蘭青蔥田內測試，防治效果顯著。於是藥毒所擴大推廣和施用這種防治法，教導農民自行生產封埋體。首先由藥毒所利用人工培育的甜菜夜蛾幼蟲，大量生產封埋體並提供農民做為接種源。
農民徒手摘取受甜菜夜蛾危害的蔥管，以減少甜菜夜蛾的危害已行之有年，因此教導農民把摘取下來的受害蔥管和藏匿其內的幼蟲，做為接種病毒的蟲源和飼料。把蔥管和幼蟲放入網袋中，再於藥毒所提供（或自行收集）的接種源（封埋體）中加入展著劑（加展著劑的目的是使封埋體更容易在葉片上存留，以防止因葉面厭水性而流失）和水混勻。把網袋浸泡於這封埋體液體內一分鐘後，取出網袋以風扇吹乾，再懸掛於室內任幼蟲取食，待三、四日後就可挑選罹病蟲放入塑膠瓶中。
每 150 到 200 隻病蟲置於一塑膠瓶中，儲存在家中冰箱的冷凍庫內備用。使用前，使冷凍庫的病蟲解凍，倒入果汁機內，每 1 千隻幼蟲以 1 公升的水稀釋混合打碎。噴灑時間以黃昏為宜，一則是這種蟲多在夜間取食，另外可避免紫外線對封埋體的破壞。利用這種方法防治後，害蟲的數量明顯降低，農民的反應都很好，這是臺灣利用核多角體病毒成功防治害蟲的例子。
基因重組的桿狀病毒
增強桿狀病毒殺蟲效果可從幾個方面著手。首先是高致病桿狀病毒株的選殖，從野外（田間）的桿狀病毒族群篩選出高致病力的品系以量產。
其次是基因重組。桿狀病毒株做為防治害蟲的生物農藥的最大缺點，是害蟲的致死時間太長，減短殺蟲時間就是改進首要之務。方法有：
基因刪除 蛻皮素萄糖轉移酶基因的產物——蛻皮素萄糖轉移酶——可使蛻皮素失活，延長幼蟲為害時間，把這基因刪除後，殺蟲速度可快 20 ~ 30％。
基因的銜入 桿狀病毒的基因體是環形的雙股 DNA 構造，而且基因體很小，因此很容易在原基因體內再加入其他的基因，構築成為一個基因重組的桿狀病毒。這些銜入的基因須具有的特質是，源自昆蟲本身的調控因子、對昆蟲具有特異性、低量就可作用、作用快，以及使寄主致死但無細胞毒性。
源自昆蟲本身的調控因子的銜入基因，包括以下幾種。
利尿激素基因——這激素大量表現會使害蟲脫水，破壞昆蟲體內水分的平衡，但殺蟲速度並不如預期，只略高於野生型病毒。
前胸腺激素基因——蛻皮素的分泌受到這基因的調控，但前胸腺激素重組病毒雖可使蛻皮素的量在害蟲體內大增，對殺蟲速度並無增益。
青春激素酯酶基因——青春激素酯酶可降解昆蟲體內的青春激素，而青春激素在昆蟲的幼蟲時期會維持一定量。這種酶可使昆蟲幼蟲體內青春激素下降，引發過早蛻皮或化蛹，生理周期受到擾亂而致死。雖然這種重組桿狀病毒不會提高感染的比率，但可以抑制害蟲發育、取食，並致死，殺蟲速度可增快 20 ~ 35％。
對昆蟲具特異性毒素的銜入基因，則包括以下幾種。
蘇力菌的內毒素基因——蘇力菌是現今使用最多的生物製劑，其內毒素基因的銜入雖可提高害蟲的致死率，但效果有限。
蠍毒基因——蠍毒是神經毒，能使昆蟲麻痺而死亡。感染蠍毒重組病毒的症狀在 36 小時就會呈現，死亡率可增加 65 ~ 75％，重要的是為害作物的量較野生型病毒降低一半。雖然如此，基於安全和風險評估，這種基因轉殖病毒目前尚無法在田間使用。
螨毒基因——這種毒素也會使昆蟲麻痺而死亡，且能增強致死率 30 ~ 40％。
胡蜂毒素——這種毒素能使昆蟲體內的黑化免疫機制提早啟動，也使昆蟲的體重無法增加，但並不能增加感染效率。
展望
現今世界上登記使用的核多角體病毒約有 35 種，在西歐（法國、德國、丹麥、荷蘭、瑞士、芬蘭等地）已有 7 種以上的病毒商品化。在北美，有 10 種桿狀病毒製劑已登記做為森林和農業害蟲的防治，其中有 8 種已商品化。北美之所以有這麼多種病毒商品化，是因為美國政府相信病毒性農藥是很安全的，且商品化的過程較其他地方簡單。
在臺灣，因為生物性農藥商品化的過程與一般化學農藥相同，要經過繁雜的程序確認對環境和其他非目標生物無危險，才允許上市，所以至今尚未有任何一種病毒殺蟲製劑商品化。
多年來，環境保護的概念已深植國人心中，有機、無毒作物的需求逐年增加。要達到「無毒農業臺灣島」的目標，對環境衝擊較低的微生物殺蟲劑是不可忽視的一環。臺灣地處亞熱帶，昆蟲資源豐富，農業發達，害蟲種類也多。同樣地，昆蟲微生物病原體資源也相當充足。然而台灣害蟲病原微生物的研發尚在起步中，下列幾點尚需努力。
加強流行病學的研究 因為這些病原體長期在野外和昆蟲並存，且每幾年就有季節性流行病發生，利用環境（尤其氣候條件）和流行病的關係，可尋求微生物殺蟲劑施用的時機和最佳條件。尤其網室或設施栽培是可雕塑的栽培環境（溫度、濕度和日照），病原體可大量感染害蟲，以增強防治效果。
篩選高致病力的本土病毒株，以及研究病原體間的交互作用 在病毒族群中，高致病力的病毒品系常是少數（因感染後的病毒子代少），應挑選出致病力較強或感染速率較快的病毒，做為種原來量產。此外，應研究病毒內和致病力及感染速率有關的基因，做為重組病毒之用。
發展大量生產病毒的技術，以降低成本 昆蟲病毒是一種絕對寄生的微生物，須由活體的昆蟲或細胞株才能繁殖和生產。然而飼養昆蟲或培養細胞生產都是不經濟的，這也是亟待解決的問題。
總而言之，期待更多青年學子的參與，讓本土性昆蟲病原微生物成為防治害蟲的主流，也讓「無毒農業臺灣島」早日實踐。
