植物內生真菌的角色
105/04/12
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蕭祺暉｜
行政院農業委員會林務局造林生產組
邱順慶｜
臺灣大學植物病理與微生物學系
曾顯雄｜
臺灣大學植物病理與微生物學系
真菌在地球的生態系統中扮演著腐生、寄生、共生等多重角色。透過和植物共生，不但能促進寄主的生長，也能增強寄主對環境逆境的適應力，對生物多樣性的維持及自然資源的應用都有重大意義。植物共生真菌的研究兼具科學樂趣與應用價值。
真菌與植物的關係
植物是動物（包括人類）生存的基礎，真菌則是植物在自然界生存的基礎。真菌與植物的關係可分為腐生、寄生與共生，每一種關係都會影響到動植物的生存與生活。但因為這類關係原本就是演化的結果，其重要性幾乎被人類忽視。
近年來因為氣候急速變遷，特別是劇烈天氣的形成，使得植物面臨生存逆境的極大挑戰。就「腐生」關係而言，植物落葉與殘枝若無真菌扮演分解者的角色，植物體的碳、氮及礦物元素將無法循環，地球表面會淹沒在日漸累積的植體殘渣中，動植物生態系也會瓦解。
就「寄生」關係而言，真菌是造成植物病害最重要的因子，其程度遠高於其他病原如藻菌、病毒、細菌、線蟲（寄生在植物內的蛔蟲）等。寄生關係所造成的影響包括作物產量減少、品質降低、農藥殘留及環境汙染、真菌毒素（花生、穀物、中藥材）等。
就「共生」關係而言，大致可分為3類。
內生菌根菌–它的特徵是會形成叢枝狀體，地表上百分之八十以上的植物都需與內生菌根菌建立互利共生的關係才能正常成長，內生菌根菌與植物的共同演化可能超過4億5千萬年，幾乎已成為共生植物根部吸收養分（特別是磷）及水分的重要「擬器官」。
外生菌根菌–特徵是會在寄主側根形成菌鞘緊緊包覆根尖，而且生長在根部細胞間（稱為哈氏網），是森林樹木傳遞生長、吸收養分及反應環境訊息的重要幫手。
內生真菌–廣義的內生真菌包含內生菌根菌及外生菌根菌，狹義的內生真菌特指生活在植物體內但不引起任何病害症狀，也不會形成叢枝狀體或菌鞘的真菌。本文介紹的就是以這類真菌為主，並以南洋紅豆杉為例，擇要說明過去15年間在臺灣大學植物病理與微生物學系所進行的台灣森林內生真菌的研究。
植物內生真菌
「植物內生真菌」意指其生活史中的一部分或全部存在於植物體內，但並未引起植物顯現病徵的真菌。在自然環境中，內生真菌幾乎存在於所有裸子植物及被子植物的組織內，扮演著增加植物適應生物性或非生物性逆境能力的角色，因而常用來作為增加作物的產量、減少耗水量，或擴大利用貧瘠與鹽化土地的推手。
依據內生真菌的類緣關係、生活史、寄主體內殖據及傳播的屬性與多樣性，以及對寄主益生的性質，可把它分成4大類。
第一類內生真菌專指屬於麥角菌科的草生內生真菌，這一類被研究的最久，了解也最深刻。對寄主草類而言，這一類內生真菌所生合成的次級代謝產物會抑制其他病原菌的感染或昆蟲的取食，可以說是彼此互利共生。但牛羊若取食這種帶菌的草類卻會發生震顫病，因此對畜牧業而言是有害的。
第二類內生真菌是指一群系統性存在於植物根、莖或葉部的真菌，這類內生真菌能增強寄主植物對棲地恆存自然因子（例如高鹽土地）或非棲地性恆存自然因子（例如乾旱、寒流）的適應力。歸屬於擔子菌Sebacinales的內生真菌就是這一類，它對促進植物生長的效果最明顯，但因無法產孢，因此其分類地位常以分子鑑定為主。
研究指出，根部內生真菌Fusarium culmorum可以增強水稻對高鹽逆境的耐受度，印度梨形孢菌可以增強植物對乾旱逆境的耐受度，而生長在溫泉周圍的植物Dichanthelium lanuginosum之所以耐熱，與根部內生真菌Curvularia protuberata可增強其對熱逆境的耐受度有關。
第三類內生真菌泛指自植物莖、葉逢機分離得到的局部性分布的真菌，這一類內生真菌近20年來被密集地分離保存，主要目的是為了尋找生理活性物質，但鮮少針對其生物特性進行研究，因此與植物的關係未明，仍需更多的研究。不管如何，經由分離及培養這類真菌所獲得的數百種次級代謝產物，已成為新藥開發的新穎領域。
第四類內生真菌專指存在於植物根部的子囊菌，這等子囊菌具有黑色素化的菌絲及隔膜，因此稱作「深色隔膜內生真菌」，例如Acephala、Cadophora、Phialocephala等屬的真菌。
其中最為人熟知的是寄主範圍（含括裸子植物及被子植物）及地理分布都非常廣的Phialocephala fortinii。這類內生真菌生長速率很慢，大部分不產孢，少部分置於低溫（攝氏4度）的環境中約半年後才產孢，以分子生物學的方法可自根部檢測到這類真菌，但有些無法以人工培養。這類內生真菌有些對植物的病原真菌具拮抗作用，可以發展成生物防治劑。
根據中央研究院生物多樣性研究中心的研究結果：如以台灣的維管束植物類估算台灣的植物比率，約占全世界的1.5％；但若以單位面積換算的植物種類平均值卻是全世界的60倍，可見台灣植物相的豐盛以及其在全球的地位與重要性。尤其是台灣植物的內生真菌更是值得探索，亟待有系統地進行森林真菌資源生物多樣性調查，以利生態保育與永續應用。
內生真菌的分離培養與保存
研究人員利用來自瑞岩溪保護區、八仙山苗圃、鞍馬山等地所採集南洋紅豆杉的枝條與葉片，分離了內生真菌。他們用流水把樣本洗淨，在無菌操作台內切取南洋紅豆杉的枝條、樹皮的韌皮部與葉片樣本，以1％次氯酸鈉消毒15至20分鐘，再以無菌水清洗3次，吸乾水分以抑制細菌的生長與汙染。把樣品切成0.5 cm × 0.5 cm置放在瓊脂固體培養平板上，在攝氏25±3度的黑暗中培養數天。培養3天後陸續切取外緣不同菌絲的單菌絲，移至PDA plate培養以純化出單一純粹菌株。
在菌株保存方面，則利用YMSA（4 g酵母萃取物、1 g蛋白（peptone）、10 g麥芽萃取物、8 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 L dH2O）斜面試管接種菌絲塊後，在攝氏30度下黑暗培養。待菌絲長滿後一周，直接或加入礦物油在攝氏4度下保存，最短可保存2年，定期每半年至一年繼代培養一次。
內生真菌的多樣性
紅豆杉科（紫杉科）現生植物除澳洲紅豆杉Austrotaxus屬產於南半球外，其他則產於北半球，台產的是穗花杉屬及紅豆杉屬。台灣產南洋紅豆杉單株點狀散生在台灣中高海拔約1,000～2,700公尺高的森林中，因其材質紋理堅硬且緻密美觀，是高級的雕刻用材，以往過度伐採與盜伐情況非常嚴重，屬於國寶級的保育類植物。
台灣產南洋紅豆杉內生真菌相多樣性，經調查發現菌落的顏色主要有白色、黑色、白轉黑、白轉紅等，不同菌群的菌落顏色也不同。內生真菌代謝使培養基產生不同顏色的外觀，主要是顏色不變、黑色、紅色及黃色，而且許多菌株都會產生抗真菌的生理活性物質，有開發成為生物防治製劑（可降低作物農藥使用）或人體動物用的抗感染藥物的潛力。目前研究人員利用rDNA序列已鑑定超過100株的內生真菌。
植物內生真菌的生態研究
植物內生真菌不管直接或間接都與人類福祉息息相關，包括對農作物生長的影響、真菌毒素及次級代謝產物在醫療製藥上的應用等，因此成為近年來日漸熱門的研究題材。內生真菌具有重要的生態學意義和經濟意義，能產生許多有潛在經濟價值的代謝產物，並且在分類學、生物防治與農業、醫學、生物技術領域等方面都有一定的應用潛力。
自然界中，真菌異營性的寄生現象普遍發生於被寄生的動物、植物等生物之間。在真菌界內，也發現許多界內寄生的例子，這類真菌寄生於另一種真菌的現象，特稱為「真菌超寄生」或「重寄生」。
內生真菌種類繁多，它們在其寄主植物組織內部的生長發育過程中，其代謝產物不僅對植物體本身有各式的影響，對取食動物或其他生物也有不同的作用。現有的研究發現某些內生真菌離體培養的代謝產物，可對一些動物的消化系統、繁殖系統、神經系統、免疫系統等產生影響。因此內生真菌有可能開發為有用的物質。
內生真菌與植物的關係
內生真菌主要通過兩種形式傳播：一是通過菌絲生長進入子房和胚株，經由宿主的種子傳播；另一是產生孢子，通過風、降水、從植物表皮的氣孔、皮孔等途徑侵入進而定居在植物莖部，是否有可能由動物、昆蟲、線蟲、傷口等途徑侵入，則有待進一步探討。
內生真菌的菌絲生長在植物組織的細胞間，分布在葉鞘、種子、花、莖、葉片和根中，其中葉鞘和種子中的菌絲含量最多，而葉片和根中含量非常少；莖部真菌僅能利用莖部基質生存，在其他組織中不能存活，這也可能是莖部真菌數較多的原因，因此內生真菌具有組織專一性。內生真菌分布在植物組織內，可獲得足夠的碳源、氮源，而且受到植物組織的良好保護，因而比暴露在惡劣環境中的寄生菌和腐生菌有更穩定的生存環境，更易於發揮它對宿主或其他生物的影響。
內生真菌主要是藉著影響宿主的代謝物質，使其產生某些生理活性物質（如生物鹼、激素等）來改變植株的生理特性，提高植株的抗逆性，刺激並促進植株生長。真菌與植物的關係非常複雜，除一般的寄生、片利共生和互利共生外，一些真菌在侵染植物造成傷口後，也會分泌一些有益的化學物質，如某些黴菌會侵染白木香樹造成傷口，使其分泌芳香物質並集結為沉香。
內生真菌與動物的關係
內生真菌是植物抵抗昆蟲、線蟲、野生動物的重要因素，有學者發現高羊茅對牛的毒性與內生真菌Acremonium coenophialum在高羊茅中的發生率相關。目前已有學者從A. lolii感染的黑麥草中分離出波胺（perzmine）和黑麥草鹼（loliterm）；也從A. coenophialum感染的高羊茅中分離出麥角胜（ergopeptide），這些生物鹼都與感染植株的抗蟲性和牲畜中毒症狀有關。內生真菌產生的生物鹼是提高感染植物抗逆境特性的化學基礎；生物鹼是由內生真菌產生的，在未感染植株中通常不含生物鹼。
某些內生真菌分離培養的代謝產物可對一些動物的消化系統、繁殖系統、神經系統、免疫系統等產生影響，因此內生真菌有可能成為開發新型有用物質的重要生物資源。
內生真菌與寄主微生物
內生真菌對植物病原菌的拮抗作用包括多種機制，如抗生作用、超寄生作用及競生作用。就台灣產南洋紅豆杉內生真菌生理拮抗作用的觀察，研究人員先以南洋紅豆杉內生真菌與植物病原菌對峙培養，再於解剖顯微鏡下觀察，標示產生拮抗現象的區域，以解剖刀切取製片，另以掃描式電子顯微鏡觀察其拮抗情形並照相記錄。
結果發現神奇的拮抗作用，包括內生真菌纏繞植物病原菌、寄主菌絲透化、內生真菌形成附著器、內生真菌侵入寄主菌絲內生長、寄主組織油滴狀、寄主菌絲扭曲、抑制寄主生長，以及內生真菌反被寄主抑制生長的現象。由內生真菌與松材線蟲的對峙培養，發現內生真菌可降低松材線蟲的活力甚至造成死亡，有些則可供松材線蟲取食並有增加現象。
由初步檢測內生真菌對重要病原會產生顯著的拮抗作用，但對南洋紅豆杉卻無明顯的不良影響，顯示它在生物防治或發展生物防治劑有潛在的應用能力，尤其是對苗木的強化和病害的預防、罹病性的降低等應會有所助益。另外，內生真菌也可應用於森林害蟲的防治、真菌病原及病原線蟲的劑型、模式等。
植物共生真菌的研究兼具科學樂趣與應用價值，歡迎有更多同好投入調查與研究，以進一步解開大自然的奧祕。
註：超寄生菌的寄主型式
超寄生菌寄生前的型式有許多種，因寄主不同或超寄生菌不同而有所變化，可歸納如下5種主要型式，這些型式可單獨發生，也可能同時發生。
胞內寄生—超寄生菌整個個體在寄主體內存活。
吸器寄生—超寄生菌產生吸器，刺穿寄主細胞壁，壓陷細胞膜，而自活的寄主細胞內獲取養分。
碰觸寄生—超寄生菌產生特化細胞，或直接以菌絲接觸寄主細胞表面，但並不侵入寄主，兩者接觸處的細胞壁溶解成小洞或透過原生質絲而取得養分。
侵入寄生—超寄生菌直接以菌絲侵入寄主細胞中，自胞質吸取養分。
纏繞寄生—超寄生菌以側生菌絲或主菌絲纏繞在寄主細胞體表，但並不侵入寄主，這型態的寄生往往在末期造成寄主死亡，細胞崩潰及細胞質流出。
