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植物保護生技：抗蟲蛋白質

94/08/04 6333

陳慶三｜中央研究院植物研究所

抗蟲綠豆

說到綠豆抗蟲蛋白質的發現，須從抗蟲綠豆談起。大約八、九年前筆者的研究團隊開始對綠豆發芽相關酵素做了一些試驗，其間曾向亞洲蔬菜研究發展中心（簡稱亞蔬中心）鄒篪生主任請益。鄒主任告訴筆者，亞蔬中心擁有全球最豐富的綠豆種原，研究人員已育成各種優良綠豆品系，其中有一種抗蟲綠豆品系，簡稱為VC6089A，能夠抵抗倉貯害蟲–豆象的蠶食。我們都認為VC6089A是研究抗蟲基因的好材料，鄒主任並慨然應允提供VC6089A做為研究材料，筆者的研究室從此展開綠豆抗蟲蛋白質的一系列研究。

有了抗蟲綠豆VC6089A之後，馬上想到的問題是它為什麼能夠抗蟲？因為農作物的蟲害是農業的重要問題之一，因此決定尋找這個問題的答案。當初亞蔬中心的研究人員把不抗蟲綠豆VC1973A（簡稱VC1973A）與來自非洲東南方馬達加斯加島的抗蟲野生種綠豆TC1966（簡稱TC1966）雜交，經過6次回交及2次自交，每次回交都是篩選具有抗豆象特性的子代，最後得到VC6089A。因此，理論上VC1973A與VC6089A這兩種綠豆的基因體含有99％相同的基因，不同的1％基因源自TC1966，其中含有抗蟲特性的基因。

VC6089A為什麼能夠抗蟲？答案顯然在上述的1％基因中。因此從這1％基因中找出抗蟲基因，再把抗蟲基因表現成蛋白質，並分析這個蛋白質是否具有抗蟲特性，應可了解VC6089A為什麼具有抗蟲性狀。

尋找綠豆抗蟲基因

我們採用扣除雜交法，用VC1973A的基因去扣除VC6089A中99％相同的基因，留下1％不相同的基因。簡單地說，由於VC1973A與VC6089A綠豆有99％相同的基因，它們DNA的序列也有99％相同。因此這兩種綠豆的99％基因能夠互相發生雜交作用，除去雜交的基因，就剩下包括抗蟲基因在內的1％基因。

這1％基因事實上代表相當多的基因，但並不是所有基因都會同時表現。我們發現VC6089A綠豆植株開花後，發育的第15天種子開始出現抗蟲特性，顯示這個時期抗蟲基因開始表現，選擇這個時期進行扣除雜交試驗，比較容易找到抗蟲基因。

我們從開花後15天發育中的VC6089A種子，篩選到18種可能與抗蟲特性有關的基因，比對這些基因與登錄在國際基因銀行的基因，找出最有可能的抗蟲基因是VrD1基因。Vr是綠豆學名（Vigna radiata）的兩個英文代表字母，D代表防禦素（defensin）的第一個字母。防禦素普遍存在於動物、植物及昆蟲中，而且同一種生物中常常發現一種以上的防禦素。VrD1是從VC6089A中找到的第一種防禦素，所以在D後面加一個1。因為VrD1是一種富含半胱胺酸（cysteine-rich）的蛋白質，在習慣上也稱為VrCRP（Vigna radiata cysteine-rich protein）。

許多研究證實，防禦素是一種富含半胱胺酸的蛋白質，是動植物及昆蟲體內固有免疫系統的重要成分。當生物體受病原菌侵襲時，會啟動這種固有免疫系統，在短時間內合成防禦素來消滅侵入的病原菌。找到VrCRP基因後，把它轉殖到大腸桿菌細胞內，利用大腸桿菌生長快速的特性，大量生產VrCRP。利用大腸桿菌培養得到的VrCRP與其他植物防禦素一樣，也能夠抑制病原菌的生長。例如立枯絲核菌是植物重要病原菌，而VrCRP能夠抑制立枯絲核菌及其他幾種病原菌的生長。

抗蟲蛋白質的應用

植物在演化過程中發展出各種防禦機制，豆科植物種子中能夠抵抗豆象危害的蛋白質有澱粉酶抑制劑、胰蛋白瓷抑制劑、豌豆球蛋白、刀豆毒蛋白及黃豆半胱胺酸蛋白瓷抑制劑等。證明這些蛋白質殺蟲或抑制害蟲生長的方法有二，其一是在飼料或人工種子中，加入抗蟲蛋白質去餵食昆蟲，觀察昆蟲死亡或生長受抑制情形，其二是把抗蟲蛋白質基因轉殖到不具抗蟲能力的作物中，然後測試轉殖作物的抗蟲能力。

筆者的研究室同時採用這兩種方法探討VrCRP的抗蟲活性，把VrCRP與VC1973A綠豆粉混在一起製備人工種子，讓豆象交配後在人工種子表面產卵。結果發現只要含0.8％ VrCRP的人工種子，就能夠完全殺死豆象幼蟲，那些不含VrCRP的人工種子，豆象幼蟲會鑽進人工種子內正常發育，羽化成成蟲。這個實驗證明VrCRP具有殺死豆象幼蟲的能力，而VrCRP應是第一個被報導具殺豆象活性的植物防禦素。隔年，澳洲的一個研究團隊也證明，菸草防禦素具有抗棉鈴蟲的活性。

目前，最普遍且能有效殺死有害昆蟲的生物農藥，首推蘇力菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）產品，約占整個生物殺蟲劑市場的90％以上。蘇力菌產品的有效成分是Bt毒蛋白。蘇力菌產品經幾十年使用下來，面臨兩大問題，第一是蘇力菌產品活性範圍狹窄，產品功效與價格不穩定，且成本昂貴；第二是蘇力菌內毒素施灑於葉面會在兩天內分解失效，須經常施灑，造成農民很大的負擔。因此，有必要開發新的蘇力菌產品或其他生物殺蟲劑，以改進蘇力菌產品的缺點，甚至超越蘇力菌產品。

VrCRP與蘇力菌毒素比較，有三點差異。第1是抗蟲範圍不同，Bt毒素主要是抗鱗翅目昆蟲，而VrD1主要在抗鞘翅目昆蟲。因此，二者間有明顯的市場區隔。第2是Bt毒蛋白源自細菌，而VrCRP則存在種子中，也可能存在於植物其他組織內，對植物細胞無毒性，因此容易用於開發轉殖作物。第3是Bt毒素只對害蟲有防治效果，VrCRP則兼具抗蟲與抗菌兩種特性，因此有利於開發成抗病蟲害生物農藥。

除了上述有利條件外，VrCRP已獲得美國專利，有利於智慧財產權的保護。另一方面，國防大學動物中心主任梁善居教授研究團隊，把VC6089A綠豆粉加入飼料餵食實驗鼠，結果顯示無明顯毒性反應。換言之，VrCRP可能無安全顧慮，但仍需做更詳細的毒性試驗，以確認其安全性。除此之外，尚需進一步提高VrCRP的產量，以降低成本，同時進行田間試驗，以確認其抗病蟲害的功效。從以上的各種跡象顯示，VrCRP確實具備開發成抗病蟲害生物農藥及抗病蟲害轉殖作物的潛力。

資料來源

《科學發展》2005年8月，392期，12 ~ 15頁

蘇力菌acillus thuringiensis(3) 科發月刊(5210)

植物保護生技：抗蟲蛋白質

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