在細胞內的生技奇航
102/08/06
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黃祖緯｜
清華大學工程與系統科學系
林士鳴｜
清華大學生物資訊與結構生物研究所
黃蘊慈｜
清華大學生物資訊與結構生物研究所
潘榮隆｜
清華大學生物資訊與結構生物研究所
陳福榮｜
清華大學工程與系統科學系
曾繁根｜
清華大學微機電系統工程研究所
演化數十億年的神祕帝國
生物細胞像一個偉大的帝國，內部有各種的部門（胞器）、各樣的建築物（蛋白質複合體）、各形各色的百姓（生物分子），各司其事，卻統籌成具緊密關係的有機體，彼此相輔相成，以維持偉大帝國的存在與功能。各個部門設有進出口，整個帝國也有出入境的海關，由多組團隊（膜蛋白）把守，以抵禦外侮或控制各種物質的進出（運輸蛋白）。
為了了解這個偉大帝國內部的組織、構造、運作功能，發展出各式的偵測技術與儀器，就如派探子潛入帝國內部打聽。但是能不能很清楚地觀察生物細胞，關鍵在於這些技術與儀器的解析度。
原子世界裡的大宇宙
在2011年1月10日，英國天文學權威里斯（Martin Rees）教授在劍橋大學發表了一場名為「宇宙中的生命（Life in the Cosmos）」的精采演說。他的論點大膽，但也充滿爭議，試圖解釋為何人類花了數千年，但還是無法得知地球外到底有沒有其他生命。
里斯教授舉用物理學家常用的銜尾蛇（Ouroboros）圖形，來象徵我們身處的這個宇宙。姑且不談難以證實的假說，在一小時的演講中，他點出了「極小可以印證極大」的觀念。也就是說，人類越了解電子、原子、分子等基礎粒子構成的微觀世界，就越能夠解釋整個宇宙運行的規則。顯微鏡與天文望遠鏡就是數十年來讓科學家得以加速科技發展與改善人類生活的關鍵鑰匙，光學顯微鏡與電子顯微鏡更是和生命科學、健康醫療，乃至能源的使用密不可分。
20世紀最偉大的物理學家之一—費曼（Richard P. Feynman; 1965年諾貝爾物理獎得主）博士，在1959年於加州理工學院舉行的美國物理學會年會的一場經典談話中，開啟了微機電技術與奈米科技的鼎盛世代。從「何不把大英百科全書寫進大頭針上」的提問來破題，提出把尺度縮小可以獲得超乎想像的大儲存空間，以及全新的科技應用。在當時的他，令人嘆為觀止地預見了現今半導體的微小製程、微型電腦及微縮機械的優勢與發展方向。
更值得一提的是，費曼博士指出生物細胞保存與傳遞生物資訊的自然機制，遠遠超過任何一種人造儲存媒體的效益，而解開其中所隱含的祕密，得倚靠更好的電子顯微鏡或其他高解析度的微觀儀器。
如果能把電子顯微鏡或其他微觀儀器的解析能力提升到單一個原子，所有生物化學的難題都可以迎刃而解：複雜物質的分析可以由原子組成來了解；分析去氧核醣核酸（DNA）序列與核醣核酸（RNA）結構可以解答蛋白質合成的路徑；甚至透過觀察葉綠素的運作，可以直接看到地球生命賴以為生的光合作用的發生與進行。
去氧核醣核酸、核醣核酸、蛋白質等生物巨分子的運作準則，是「它們的功能、立體形狀及原子三維結構之間有非常密切的關聯」。舉凡酵素催化的發生、抗體和抗原間的結合、病毒轉殖的進行、膜蛋白離子通道的運作，乃至標靶藥物辨識癌細胞等，都可以透過電子顯微鏡或微觀儀器與設備的成像技術，藉由一系列不同時間點所取得的三維形貌和原子結構影像，讓科學家觀察動態的分子形貌改變過程，建立可信的生理機制模型，幫助我們預防與治療疾病。
生物影像的華麗挑戰
最先進的顯微影像技術應該具備的條件，包括：能看得夠小（空間解析）、看得夠快（時間解析）、看見物體的輪廓夠明顯（影像對比）與夠立體（三維度影像）。
舉例來說，在半導體製造中，積體電路（integrated circuits, IC）需要檢視的最小線寬大約在20奈米左右。通常，所使用材料的原子質量較大，並有相當的差距（例如，矽的原子質量28，二氧化矽的平均分子質量60），而且僅需要靜態的量測，因此使用電子顯微鏡來觀測它的奈米結構確實是遊刃有餘。
然而，在生物細胞內的生化反應，通常發生在千分之一秒的時間內，參與反應的分子結構的尺寸都在1～3奈米左右，組成元素的原子質量輕且接近（像是碳12、氮14、氧16），因此要動態解析它們的反應過程是較困難的。
在各種生物顯像術中，公認電子顯微鏡擁有最好的空間解析力，尤其是經過像差修正後，甚至可以達到次埃（sub-Å，十分之一的原子大小）等級。
但是在電子顯微鏡對蛋白質、病毒等生物樣品的拍攝技術上，仍然有幾點瓶頸尚待突破：生物樣本基本上都由較輕的元素，例如碳及氫元素組成，影像對比較不好；生物樣品容易受到電子輻射以及真空環境的破壞，無法保存它們生鮮活潑的狀態；受限於電子顯微鏡的二維投射成像原理，即使具有單粒子三維斷層圖和多拍攝角度全像斷層術的技術，目前的三維影像技術仍然無法達到原子級的分辨率。
上述的前兩項關鍵因素，不但限制了生物樣品在空間上的解析能力，也造成生物樣品的變形與破壞。為了降低電子輻射的破壞，人們開發出低溫顯微技術，使得蛋白質和病毒的可觀測時間可以延長，但也無法把生物樣品鮮活地維持在原始的液態環境中。因此，科學家們僅能觀測冷凍後的樣品結構，既不能同時記錄生物樣品隨時間的變化，更無從了解分子尺度下，生物樣品的動態功能與結構改變之間的關係。
雖然目前的電子顯微技術尚未達到如費曼博士在五十多年前希望的樣子，能夠直接「看到」並且「控制」原子的排列，來製造所需的化合物或生物分子，但全世界頂尖科學家們正夜以繼日地努力，這些夢想將會實現。因此，未來的電子顯微鏡可以把生物樣品保持在自然原始液態環境下，「看見」生物樣品隨時間變化的動態過程，以了解分子尺度下功能與三維原子結構之間的關係，甚至可以隨心所欲地製造想要的各種奈米等級的分子。
電子顯微鏡的再進化
清華大學軟物質電鏡中心正積極發展「活體生物電子顯微鏡」技術，整合了新型的微型溼室環境腔、微相位板，以及三維原子分辨率斷層攝影學理論等關鍵技術於一身，希望能直接觀看活體生物分子的動態。
簡單地說，活體生物電子顯微鏡配備了以奈微米製程技術加工的微溼室環境腔和微型靜電透鏡－相位板。藉由相位板取得電子波後，分子的三維原子結構和形貌可以透過最近發展出的大爆炸及倒溯波斷層攝影技術，由二維具有相位訊息的影像重構成三維具有原子分辨率的斷層攝影圖。
結合這些關鍵技術與設備後，這一個電子顯微鏡將展現3種強大功能：活體細胞可以在環境腔體中保存與觀察、影像解析度可以達到原子等級、可以形成三維立體影像。這樣一來，不但能夠解決觀看蛋白質∕離子動態的問題，也可以應用在觀看像是葉綠素的反應作用與動態、病毒與細胞作用，以及其他重要研究課題上。
在活體生物電子顯微鏡中，用來保存細胞活體狀態的微型溼室環境腔的構造包括一對上下蓋。在上下蓋中央，有一層約20奈米厚的氮化矽薄膜窗口，可以隔絕電子顯微鏡內部的真空和環境腔內部的液體。衣藻是地球上最早能行光合作用的生物，由於電子顯微鏡的解析度大於光學顯微鏡，可以清晰地看到奈米等級的衣藻鞭毛，一般的光學顯微鏡則無法做到。
在2012年，《科學》（Science）期刊報導，如果能利用石墨烯做窗口，影像的解析度甚至可以達到原子級的分辨率，這也是未來會整合到溼室環境腔的重要技術之一。
相位板運作的原理，是藉由改變穿透光束前進的相位，使得它與高角度波的波程相差1∕4波長。相位板首先應用在光學顯微鏡上，用來增加生物樣品的對比。哲尼克（Frits Zernike, 1888-1966）教授也因為這一項貢獻，在1953年得到諾貝爾物理獎。除此之外，永山國昭（Kuniaki Nagayama）教授首先利用碳膜在電子顯微鏡上展示出類似於光學顯微鏡的襯度增加。可惜的是，因為碳膜的厚度是固定的，因此碳膜只能用來改變單一種的固定相位，無法隨需求調整。
在筆者團隊的研究工作中，使用矽奈微米加工製程技術製造微小靜電透鏡（相位板），可以藉由改變金電極上的外加電壓，動態即時調控穿透電子束的相位。因此，利用這一個可調相位的靜電式相位板，可以連續拍攝不同相位對比的影像，而有別於傳統式相位板只能拍攝一張固定相位對比的影像。有連續不同相位對比的影像的好處，是可以如同全像術般重新構成樣品的電子波，而不只是影像。
此外，也利用ε15 噬菌體病毒殼體的結構為例子，模擬出不同相位差（0、π∕4、π∕2、3π∕4及π）的影像，並顯示重構樣品的電子波。這些電子波在一定的外在條件下，可以重新組合成三維度影像（全像）。
這樣的攝影術正是清華大學軟物質電鏡中心最新發展出來的技術，而且榮登在2012年《自然》（Nature）期刊中。它又稱作「大爆炸原子分辨率3D攝影術」（big-bang tomography），是受到天文物理大爆炸學說的啟發，能夠僅由一個樣品投影方向重構出三維的原子結構。
這一個新技術遠優於目前學界主流使用的冷凍電鏡3D攝影術，冷凍3D攝影技術需要仰賴近上百次的異方向樣品拍攝，以及耗費近200天的電腦運算，才可以獲得奈米分辨率的結構模型，因此要獲得三維動態的連續資訊有時效上的困難度。
天文物理學中的哈伯方程式，描述大爆炸發生後，越遠的星球會以越快的速度向外遠離，科學家藉由觀察各星球間的運動關係，便可以測出宇宙誕生（大爆炸）的時間原點。有趣的是，電子顯微術傳遞到電鏡影像平面上的原子波的「角度」及「相位（波峰的相對位置）」也有類似的相依關係，這正是推估原子空間位置的重要線索。如果可以善用這一套嶄新的大爆炸3D攝影理論，甚至可以應用到非周期結構的材料或蛋白質等軟物質的觀測上，量測精準度更可以高達0.2埃（Å）。
筆者的研究團隊也以石墨烯上的蛋白質RuvA（一種參與DNA重組或修補的蛋白質）為模型，利用樣品電子波和上述的大爆炸及倒溯波斷層攝影學，重構出在石墨烯上蛋白質RuvA的三維原子結構。
隱藏在細胞中的人類未來
奈米電子顯微鏡在生物分子上的應用極具潛力，它的發展對人類前途也會有巨大的影響。例如，在1940年代左右，就已經發現細胞中最重要的能量來源之一—腺嘌呤三磷酸（ATP）；到了1960年代，康乃爾大學的雷克（Efrain Racker）教授等人從粒線體中分離出腺嘌呤三磷酸合成酶，也就是廣為人知的F型FOF1—腺嘌呤三磷酸合成酶。
有別於其他酵素的運作機制，加州大學洛杉磯分校的波義爾（Paul D. Boyer，1997年諾貝爾化學獎得主）教授等人提出F型FOF1—腺嘌呤三磷酸合成酶是以旋轉的方式合成及分解腺嘌呤三磷酸的理論，宛如一個存在於細胞中的微型馬達，可說是自然界中最小的馬達。
六十年後的今日，人們已經可以利用原子力顯微鏡（atomic force microscope，簡稱AFM）等奈米技術，直接觀察F型FOF1—腺嘌呤三磷酸合成酶的分子構形及旋轉模式，以及其他多種生物馬達包括驅動蛋白、肌球蛋白等沿著微管軌道的滑行模式。
在2000年，美國康乃爾大學更以這奈米馬達的構想，成功地發展出人造奈米機器人，未來可以運用在人體的奈米偵測、進行生物體自我組裝、細胞修復、藥物承載等醫療應用上。
科學家除了運用奈米影像技術之外，也利用Ｘ光晶體學的方式研究蛋白質的高解析度分子結構。Ｘ光晶體學是一項發展成熟的學門，早在20世紀初期剛發現Ｘ光之際，1915年諾貝爾物理獎得主的布拉格父子檔（Lawrence Bragg和William Bragg）便利用Ｘ光晶體學研究一些小分子無機鹽類的結構。由於晶體具有規則排列的特性，就像一個由分子所構成的光柵，能夠使Ｘ光產生繞射圖譜，藉由分析這些繞射圖譜，得以反推這些光柵（分子）的原子級結構。
透過了解蛋白質的原子級結構，可以設計出能與它產生專一性結合的小分子藥物，用以調控蛋白質的功能與活性，進而影響細胞生理而改善失衡的病理狀態。然而，小分子藥物要進入細胞產生藥效，必須穿越嚴密的細胞膜才能與細胞中的蛋白質結合，因此位在細胞膜表面的膜蛋白質便成為很好的藥物標的。
但是膜蛋白質難溶於水，使得它在功能與結構的研究上困難重重。為了克服這個難題，科學家們在不破壞蛋白質活性的前提下，利用界面活性劑增加膜蛋白的溶解度，進而解析出它們的結構與功能。近年來，已成功解析的膜蛋白質原子結構數目大幅成長，這也使未來小分子藥物有更多的發展空間，對於增進人類健康與生命品質更有深遠的影響。
除此之外，可以利用Ｘ光晶體繞射技術，把奈米科技應用在太陽能的研究上。例如，植物或光合作用細菌的光合系統中的反應中心構造，可以由Ｘ光晶體或原子力顯微鏡解析出來，並把它們放置在太陽能電池板上實驗。這樣的研究與設計可以幫助人類了解植物如何利用太陽能，以光合作用把太陽能高效地轉換成化學能及電能，以供植物、細菌生長所需。
太陽能是人類可以利用最豐富的資源，對於長期仰賴能源進口的臺灣，學習植物和光合作用細菌如何有效捕捉、利用與儲存廣大的太陽能源，以製作仿生材料，是未來值得研究的議題。
生物體是上帝最偉大的創造，它的構造精密、功能複雜令人嘆為觀止。21世紀是生命科學的時代，為了研究它的最小單位—細胞，以及細胞內的胞器、生物分子，更有賴於可以觀察細微，甚至原、分子層次構造與功能的儀器與設備。近年來興起的奈米科技、Ｘ光結晶學、高解析度電子顯微鏡術等，大約可以滿足一段時間的需求。但要更精確地觀察構造與生化反應動態，仍待更多的投入與努力，才能使人類真正認識生命體的偉大與奧妙。
誌謝：感謝國科會與中研院給予研究經費上的補助，俾利研究的完成。
