端粒酶的發現
99/09/02
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尤泰元｜
陽明大學生物藥學研究所
林敬哲｜
陽明大學生物藥學研究所
端粒和端粒酶的發現
1982 年，Elizabeth Blackburn 和 Jack Szostak 發現染色體末端具特殊序列的端粒（telomeres），能夠保護染色體避免被降解。之後在 1985 年，Blackburn 實驗室的研究生 Carol Greider 在生物體內找到了能夠合成這種特殊序列的端粒酶（telomerase）。這 3 位美國科學家在端粒和端粒酶上的重大發現，為 1980 年代後的細胞生物學打開了嶄新的一頁，特別是在老化以及癌症領域。一直到今天，端粒相關研究仍然持續不墜，也因此為他們贏得了 2009 年的諾貝爾生理醫學獎。
不完美的端粒複製機制
端粒是染色體末端的特殊結構，在 1930 年代，Hermann Muller（1946 年諾貝爾生理醫學獎得主）和 Barbara McClintock（1983 年諾貝爾生理醫學獎得主）發現它可以保護 DNA，防止 DNA 被重組。端粒這個名詞是由 Muller 所命名的，在希臘字裡，telo 意指末端，mero 意指單位。
不過當時只知道染色體末端具有這特殊結構，對端粒保護 DNA 的機制和其序列一無所知。一直到了西元 1953 年後，James Watson 和 Francis Crick（1962 年諾貝爾生理醫學獎得主）提出 DNA 的結構，以及 Arthur Kornberg（1959 年諾貝爾生理醫學獎得主）發現 DNA 複製酶（DNA polymerase）複製 DNA 的機制後，端粒的重要性才逐漸受到注意。
當時已經知道真核生物的染色體是由許多條線性的 DNA 所組成的，在細胞分裂的過程中，染色體 DNA 也隨著複製。當複製 DNA 時，必須遵循一定的方向：雙股 DNA 中的一股必須藉由短的核醣核酸（RNA）來引導其複製。隨後，進行 DNA 複製的酵素把短的 RNA 引子移除，並且填補空缺而成為一連續的 DNA 分子。
但是當最後一個 RNA 引子被移除後，DNA 複製酵素無法填補缺少的部分，於是在末端的地方就會殘留空隙，染色體的末端便會短少 50 ~ 200 個核酸序列。如此經過不斷的細胞複製後，導致雙股 DNA 的末端也會隨著分裂次數的增加而變短，這稱為線性 DNA 末端複製缺陷。
然而，一顆受精卵變成一個完全的個體，要經過無數次的細胞分裂，可想而知，細胞一定有一個特殊的機制來解決「DNA 末端複製缺陷」所衍生問題。染色體末端的端粒有甚麼特殊的結構，以及細胞如何解決 DNA 末端複製的缺陷，這些難題也因此逐漸受到科學家的重視。
發現端粒序列
一切的故事始於西元 1975 年。當時 Blackburn 剛從英國劍橋大學的 Fred Sanger（因定出胰島素序列及發明 DNA 定序法，分別得到 1958 和 1980 年諾貝爾化學獎）實驗室完成她的博士學業，並到美國耶魯大學的 Joe Gall 實驗室進行博士後研究。Blackburn 想利用她學得的 DNA 定序法，找出端粒這種末端 DNA 的特殊序列。
然而那年代的 DNA 重組技術仍未成熟，這些末端 DNA 序列無法用一般的重組 DNA 技術分離複製，DNA 定序技術也只能將較小片段的 DNA 定序，因此無法從一般動物細胞中分離純化這種末端 DNA。
幸好 Gall 發現了一種類似草履蟲的四膜蟲，這種原生動物細胞內有非常大量的線性微小核醣體 DNA，可以很容易純化取得，因此能拿來做為研究 DNA 末端序列的材料。由於選擇了一個很適合的研究材料，Blackburn 得以發現這種微小核醣體 DNA 的末端，是由 TTGGGG 這 6 個鹼基序列重複約 20 ~ 70 次所組成的。
1977 年，Blackburn 到加州大學舊金山分校演講她發現的結果，一位學生在演講後問她，核醣體 DNA 末端的 TTGGGG 重複次數不同，是因為 TTGGGG 這序列加到 DNA 末端的次數不同所造成的嗎？雖然 Blackburn 也如此認為，但在當下卻無實驗證據可據以回答。這個問題一直到 Blackburn 在加州大學柏克萊分校建立了自己的實驗室，經過數年的研究後，才證實核醣體 DNA 上的 TTGGGG 重複序列的確是後來才加上去的。
然而，這種在四膜蟲核醣體線性 DNA 末端的 TTGGGG 末端重複序列，就是一般染色體末端的端粒嗎？這種重複序列是否可以保護線狀 DNA 的完整性？這些問題仍沒有答案。
端粒延長機制
大約在同時，Szostak 在康乃爾大學利用酵母菌研究 DNA 如何重組。Szostak 在 Ray Wu 的實驗室完成了博士學位，1979 年到波士頓的 Sidney Farber 癌症研究中心建立了自己的實驗室。在酵母菌的研究中，他注意到當線狀 DNA 送入酵母菌後，會快速地降解或重組，然而 Blackburn 在四膜蟲中發現的核醣體 DNA 雖然也是線狀，卻可以持續保存在四膜蟲的細胞核內。於是，他大膽假設：也許 TTGGGG 重複序列可以保護線性 DNA 的穩定。
1980 年，在一個於新罕布夏州舉辦的 DNA 研究研討會中，Szostak 詢問 Blackburn 合作研究端粒的意願，他提出了一個瘋狂而有趣的實驗：把四膜蟲中的 TTGGGG 重複序列純化出來，接到酵母菌的某段線性 DNA 末端，觀察是否能保護這段 DNA 不被重組或水解，並讓這段 DNA 可以在細胞中複製、轉殖。酵母菌和四膜蟲在生物界的親緣關係很遠，沒有任何的證據和理由可以支持酵母菌的端粒和四膜蟲的端粒有相同或類似的序列、結構，更何況要讓四膜蟲的端粒在酵母菌體內也具有功能並保護 DNA 末端。
無論如何，這個瘋狂想法後來被他們證實成功了：TTGGGG 重複序列加到 DNA 末端後，可保護線狀 DNA 免於被重組或降解，並幫助 DNA 在酵母菌內複製。有趣的是，當 Blackburn 實驗室的成員 Janis Shampay 後來純化這段送入酵母菌的 DNA 後，發現酵母菌以自己本身的端粒重複序列 TG1-3 加到四膜蟲的 TTGGGG 端粒序列後面，說明了酵母菌可以利用本身的端粒複製機制來延長四膜蟲的端粒序列。這項研究結果也證明在真核細胞中，複製端粒的基本機制可能是很類似的。
Szostak 的發現不只幫助人類了解端粒的功能，也促成了在酵母菌中製造「人造染色體」的想法。Szostak 實驗室的研究生 Anderw Murray 後來發現，只要結合中心粒、DNA 複製起始點、端粒的序列，以及適當長度的 DNA，就可以被酵母菌視為正常的染色體，跟著細胞一起分裂，持續在細胞中複製、保存。這種人造染色體在之後應用於人類基因體分析和序列解碼上，有很卓越的貢獻。
發現端粒酶
端粒的序列被 Blackburn 定序出來後，不論在四膜蟲或酵母菌中，都發現含有大量的鳥糞嘌呤形成的重複序列。Szostak 也發現細胞會利用某種未知的機制，把這樣特殊的 DNA 序列加到 DNA 末端。究竟這種未知的機制是什麼？是否由一種仍未發現的「端粒序列轉移酵素」，把一段 DNA 轉移到另一段 DNA 末端？這些問題最後被 Greider 所發現的端粒酶所解答。
Greider 的雙親都是科學家，高中畢業後，她離開家鄉到加州大學 Santa Barbara 分校讀書。進入大學後，她就展現了對研究的極大興趣，積極參觀了幾個實驗室。大二時，她進到生物化學實驗室，和周遭的伙伴一起討論實驗，思考如何解決遇到的問題。
由於那種在充滿腦力激盪和共同進步環境下的感覺一直讓她無法忘懷，因此從大學畢業後，她就申請了加州多個大學的分子生物研究所學程。然而只有兩所學校願意給她面試的機會，因為令人難以置信的是，這位諾貝爾獎得主其實是個閱讀障礙患者。即使她有好的研究經驗、好的推薦信，甚至傑出的成績，但在參與美國研究生入學資格考這種有限制時間的正式考試時，卻無法順利地閱讀考題。
所幸，Blackburn 願意給她機會，在 1984 年，Greider 進入 Blackburn 的實驗室，開始在四膜蟲體內尋找能夠延長端粒序列的酵素。這是個困難的實驗，因為自然界是否有這種酵素存在仍是未知數。Blackburn 曾經說：「一個害怕失敗的人，通常不會選擇這種充滿不確定性的題目來研究。」
Greider 清楚這個實驗的困難度，但她顯然不怕失敗，埋頭進行研究，一天經常工作達 12 個小時。由於她的不斷努力，終於在 9 個月後的耶誕節，奇蹟似地在四膜蟲細胞萃取液中分析到她一直尋找的酵素活性，可以把 TTGGGG 這 6 個鹼基重複地加到端粒序列後面。
如果你覺得這時候她們會開香檳慶祝，那就錯了！Greider 曾經提及：「當你發現一件符合你預期的成功實驗結果時，第一件事就是要再三確認這成果是否是真的？有沒有別種解釋方式？之後你會開始怪自己當初怎麼沒想到其他的解釋方式，為什麼當初不多做一個步驟去排除這些可能？到最後你早就忘記一開始的興奮，只會一直怪自己笨。」於是又經過 7 個月的努力，排除了各種其他的可能解釋，最終證實四膜蟲體內的確有可以延長端粒序列的酵素。
Blackburn 和 Greider 最初把這酵素命名為「端粒序列轉移酵素」，簡稱為「端粒酶」。後來更進一步研究，他們發現端粒酶是個利用 RNA 為模板合成出 DNA 的反轉錄酶。
細胞複製老化
端粒酶可以利用 RNA 模板去延長 DNA 末端的端粒序列，因此染色體 DNA 不會隨著細胞複製越變越短，也解決了先前所提到的「DNA 末端複製缺陷」的問題。但如果端粒酶或端粒喪失保護 DNA 的功能，細胞會發生怎樣的變化呢？Szostak 實驗室的博士後研究員 Vicki Lundblad 發現一種特別的酵母菌突變株，這種酵母菌會喪失延長端粒的功能，因此端粒會因為「DNA 末端複製缺陷」隨著細胞複製而持續變短。當端粒短到無法再保護 DNA 時，細胞就會開始抑制本身的生長、複製，稱為複製老化。
後續的研究發現，這些會造成老化的突變多發生在端粒酶相關的基因上。有趣的是，這樣的複製衰老也發生在人類的細胞中。Greider 和加拿大 McMaster 大學的 Calvin Harley 合作，發現整體來說，老年人的端粒比小孩的短。人類成體細胞因為缺少端粒酶的表現，隨著複製次數的增加，端粒會持續縮短。由於老年人的細胞經過較多次的分裂，端粒損耗較多，最後逐漸走向複製衰老。因此，端粒的長度可以說是計算細胞分裂次數的計時沙漏，當沙子漏完時，細胞便不再分裂而衰老。
端粒酶與癌症的關係
在正常情形下，老化的現象是生命必然的周期，如果這樣的周期失去調控，常常會有可怕的後果。例如癌細胞原本是身體的正常細胞，這些正常的細胞由於某些因素導致基因不正常的「開啟」或「關閉」，於是傷害逐漸累積，細胞進而癌化。癌化細胞經常可以避開老化的生命周期，進行無限制的快速分裂，於是這些大量增生的「腫瘤」影響了正常細胞的生理功能，甚至致命。
1994 年 Woodring E. Wright 與 Jerry W. Shay 的實驗室發現，相較於正常人體細胞不表現端粒酶活性，癌症細胞會活化端粒酶的表現，藉以維持端粒長度供細胞複製用。後續的研究更指出，約百分之九十的癌細胞組織中，端粒酶的活性處在一個「開啟」狀態。端粒酶活性的活化維持了端粒的長度，可使細胞不致進入複製性的老化，就好比不斷地添加沙子到沙漏中，使沙子沒有流完的一天。因此癌細胞不會產生複製性的老化現象，可以不受限制地增生複製。
如果抑制了端粒酶的活性，是否可以使癌細胞失去無限增生的能力，進而抑制癌症的發展？尋求抑制端粒酶活性的藥物，配合抗癌藥物的使用，這種雙管齊下的治療方式是目前癌症治療的方向之一。而且由於正常成體細胞沒有端粒酶活性，會減低被這類藥物影響所引起的副作用。也因為如此，端粒酶相關的研究蓬勃發展。1994 年以前，端粒酶的相關研究每年只有少數幾篇報告，但 1994 年以後，呈指數成長，在 2005 年，端粒酶相關研究已達每年六千多篇。
雖然端粒酶相關研究領域已吸引許多科學家的注意和興趣，研究得以快速進展，然而仍有許多問題待釐清。舉例來說，細胞維持端粒長度的機制尚未完全明瞭。已有研究指出，一旦在細胞上使用端粒酶的抑制藥物，細胞仍然可以利用如 DNA 重組來達成增長端粒的效果，以躲過老化的結果。細胞究竟如何利用 DNA 重組方法來延長端粒，則是個謎題。
此外，端粒酶的「開啟」與「關閉」之間的調控機制仍然未完全清楚了解，甚至這方面的基礎研究成果要用於醫藥應用上仍嫌不足。因此仍然需要科學家的共同努力研究，以期不久的未來，對端粒延長的機制有更進一步的認識，以利老化和抗癌藥物的開發。
科學家的互動與科學發展
在實驗室中，Blackburn 和 Greider 之間的相處很有趣。她們在討論實驗時，常常對一個問題持相反的意見，然後開始互相辯解說服對方相信自己，一直到兩方都開始相信對方說得有道理，接受自己的想法才停止。
真理是越辯越明的，很多實驗遇到的問題也在她們兩個的討論之下，有了互相都可以接受的解決方式，而最後順利解決問題，甚至常常有令人驚艷的想法在爭論的過程中萌生。身為老師的 Blackburn 自己也說，她很享受跟 Greider 討論科學的過程。能遇到如此亦師亦友的研究伙伴，相信也是 Greider 的機運。
在 1985 年 4 月加州大學洛杉磯分校舉辦的一個研討會上，Greider 第 1 次對外發表她在四膜蟲體內發現的「端粒序列末端轉移酵素」，可惜似乎沒有獲得太大回響。可能是端粒的研究在當時仍然沒有引起大家的重視，一些學者甚至批評她迷失方向。只有包括 Szostak 實驗室的少數科學家，意識到 Greider 研究成果所具有的指標性意義。會後的討論時刻，Szostak 甚至邀請 Greider 去參加他們舉辦的宴會，對 Greider 來說，這是一種相當程度上的肯定和支持，讓她可以繼續鑽研當時不被大家認同的研究。
這也說明了許多專門的尖端研究是孤單的，而一旦遇到可以溝通、討論的伙伴，是非常振奮人心的。此外，不同研究領域之間的合作是很重要的，例如觀察四膜蟲端粒在酵母菌體內的作用，是集合不同觀點的想法而激發出來的創意。
科學發展的本源
不論是 Blackburn、Greider 或是 Szostak，他們當初會進行端粒酶的相關研究，其實純粹是好奇心驅使。Blackburn 一開始只是想研究端粒有怎樣的特殊序列，後來意外發現這樣的特殊序列具有重複性。接下來和 Szostak 合作，只是想觀察端粒序列能不能保護 DNA 被降解，又意外發現不同生物種族間具有相同的複製端粒機制。因此開始思考是否有特別的機制來合成這些端粒序列，最後發現未知的端粒反轉錄酶。
有趣的是，當初用四膜蟲或酵母菌做為研究的實驗材料，沒有想到相關的研究後來可以廣泛地運用到細胞老化，甚至癌症研究上。
2009 年的諾貝爾生理醫學獎的頒發，告訴我們科學研究的起源不一定要多偉大、多有意義，重要的是好奇心的驅使而想進一步研究生物界的基本問題。如果沒有 Szostak 瘋狂而大膽的想法，又如何成就之後如雨後春筍般蓬勃發展的端粒酶研究呢？對研究本身抱持的態度與信念，會決定你是個怎樣的科學家。
Greider 曾說過，科學家應該具備一種非常直觀、誠實的科學原則，不要過分誇張事實（Don't overstate things），以實事求是的精神，並充分討論，甚至可和不同領域的人一同合作，鑽研、努力於任何你想回答的有趣問題。最後這些努力累積起來，常常會是出乎意外的成就。
【2009年諾貝爾生理醫學獎】
