畜產遺傳資源：微生物多源基因庫
95/09/05
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廖仁寶｜
行政院農業委員會畜產試驗所
什麼是多源基因組
多源基因組（體），顧名思義就是來自多種生物源的基因組（體），是由英文metagenome翻譯過來的。這個字是美國學者韓德斯嫚於1998年創造的，它是由meta-analysis與genome二字合成而來。其中meta-analysis是統計學上的用詞，其意義在聯合多種個別分析的過程。而genome則是一個自2000年完成人類基因排序後，大家比較熟悉的字，它的意思是生物細胞的遺傳物質。並由這產生了許多相關的衍生字，如多源基因體學（metagenomics）、多源基因庫（metagenomic library）等。
在微生物多源基因庫的建構過程中，不用針對樣品中的微生物進行培養與分離步驟，因此可以把目前無法經人工培養的微生物基因組納入基因庫中，以增加基因庫的多樣性。最重要的是透過這種技術，便可利用以往無法窺究但又極具價值的微生物遺傳資源。
微生物種類
隨著環境的過度開發，直接與間接地破壞物種與生態，導致地球上生物的多樣性逐漸喪失。因此近幾年來，生物多樣性的保護成為世界各國甚為重視的議題之一。生物多樣性包括遺傳多樣性、物種多樣性及生態系多樣性3個部分，三者關係密不可分。
生物遺傳多樣性的發展，實因物種為適應生存環境演化而來，遺傳多樣性愈豐富，物種適應環境的潛力愈大。遺傳多樣性是自然力所形成的，包含很多珍貴但未知的資源，是一座寶藏，可對未來人類與生物延續提供幫助。根據紀錄顯示，目前全世界約有140萬種物種，但也有研究指出，地球上可能有3千萬種物種，而微生物的種類應該有數百萬到千萬之譜。由於絕大部分的微生物無法經由人類的培養分類，因此目前已知的微生物僅11萬種而已。
微生物鑑定
微生物遍布整個生物圈，但絕大部分仍未被研究，因為傳統的標準培養方式對大部分的微生物行不通，可被培養的僅占其中的1％而已，未知或不能培養的微生物占了99％。為了探討微生物的多樣性，必須發展出一套不需經微生物培養步驟就可進行評估的技術。
通常是採用分子演化遺傳法，而探討微生物的標的是小次單位核醣體核醣核酸基因，利用退化性通用引子，把經過聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction, PCR）增幅後的產物選殖於載體上，再進行去氧核醣核酸（DNA）序列解析。依據各個不同的小次單位核醣體核醣核酸基因序列做演化分析，就可發現許多預期外的演化類緣，即使是其中某些類緣與已知生物差距很遠，但對生物圈的影響也提供了某種程度的貢獻。
多源基因庫的建構
在大自然裡，微生物含有豐富的遺傳資源可供挖掘，但限於目前標準的分離菌株技術，超過99％的微生物無法透過實驗室中的操作加以單獨分離。因此，為了保存並利用環境微生物的遺傳多樣性，必須開發不需要分離菌株步驟的新技術，其中以直接建構基因庫的方式最為簡單可行。
建構基因庫的步驟是先把環境樣品，如土壤、堆肥、活性污泥、厭氣沉澱物或瘤胃（反芻動物的第一個胃）內容物，經由直接或間接的方式萃取其中微生物的DNA。若以直接的方式萃取，可得到非常多種微生物的DNA，但DNA分子通常會小於5萬鹼基對。若以間接的方式萃取，則可得到分子量較大的DNA，這種大片段的DNA，最大可達100萬鹼基對，但微生物的多樣性會降低。
微生物DNA萃取出來後的下一個步驟，就是經由物理性或限制酶加以適當切割，再接合於載體上。載體的種類依能攜帶外源基因片段的大小可分成三類，第一類是質體（plasmid），可攜帶的片段大小約為1萬鹼基對以下，第二類是噬菌粒（cosmid）或fosmid，可攜帶的片段大小約為2萬至4萬鹼基對之間，第三類是細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BAC），可攜帶的片段大小可達20萬鹼基對。然後轉形於宿主細胞（通常是大腸桿菌）中，如此形成的基因庫稱為多源基因庫。
一般而言，質體系統建構的基因庫株系龐大，動輒數十萬個，而BAC系統建構的基因庫株系較小，約數萬個左右，噬菌粒或fosmid系統建構的基因庫株系，數目介於前二者之間。有了基因庫後，最重要的目標就是篩選具有學術或產業價值的基因。小片段DNA基因庫適合單一表現基因或小基因叢的篩選，而大片段DNA基因庫則適合單一表現基因或大基因叢的篩選。至於篩選的方式目前也有兩種，一種是功能導向的篩選方式，另一種是序列導向的篩選方式。
所謂功能導向的篩選方式，是利用基因的表現會造成外觀上的改變，來做為篩選的依據。例如胞外蛋白酶基因在表現時會分泌於細胞外，造成如含脫脂奶粉的選擇性培養基，在菌落周圍產生透明圈的現象，這是因為脫脂奶粉是蛋白瓷的受質，當其被分解時，培養基就會顯現透明狀態。利用這種方式，可大量且快速地篩選標的基因。
然而，也有許多的基因無法表現或已表現但無法產生外觀上有變化的產物，因此就必須採用第二種篩選方式。把標的基因與相關的其他已知基因序列做比對分析，以選擇DNA序列相似性較高的區域序列，設計實驗檢測用的雜交探針或PCR引子，再利用雜交方式或PCR來篩選基因庫中可能含有的標的基因。通常第二種篩選方式較第一種複雜，也比較費時、費工及耗費成本。
把篩選得到具有生物活性的株系，進一步研究其DNA序列與其基因產物的生化特性。至此，最起碼已提供了具學術價值的資料，接下來則是進一步評估這個基因產物是否具有產業價值。
多源基因庫的價值
目前國外已經有很多學術研究機構或生技公司，採用這種多源基因庫的建構，藉以篩選含有生物活性的株系。例如在美國股市那斯達克上市且具知名度的生物科技公司戴維莎（Diversa），從全世界各地採集了各種不同包山包海的樣品，建構了各種的多源基因庫，發展出大量篩選基因的技術平臺，同時也發現了許多有用的基因，更擁有傲人的智慧財產權。
國外學術研究機構利用這種技術，發現了一些新穎且可供研究與利用的新物質，如抗生素、維生素、生合成雙醇、脂肪酶、蛋白酶、去氫酶、多醣修飾酶等。但在國內，這方面的研究才剛起步，為了從環境微生物中獲得對人類或其他生物有用的新穎資源，有必要投注更多的人力在這個新的研究主題上。況且臺灣的生物多樣性相當豐富，若能結合相關單位建構多種環境多源基因庫，群策群力、互相合作下應該會有豐碩成果的展現。
國內的現況
畜產試驗所從民國93年起開始進行這方面的研究，目標著重在畜產環境微生物多源基因庫的建構與利用。先期鎖定的環境樣品是雞糞堆肥，主要著眼於雞隻消化道較短，以致飼料利用率較差，使得雞糞中含有較多的蛋白質殘留，推測在堆肥中應該有較多能產生胞外蛋白酶的微生物。蛋白酶的應用性相當廣泛，約占工業用酶銷售量的40％，可用於清潔劑、食物、飼料添加、製藥、製革、廢棄物處理與銀的回收，未來市場還會持續擴大。
基於以上所述的利基，我們嘗試從雞糞堆肥樣品中尋找有產業價值的新穎蛋白酶，且採取傳統分離篩菌與多源基因庫建構兩者並行的方式，一方面可以篩選出具有良好分泌胞外蛋白酶且可培養的高溫菌株，一方面則用建構多源基因庫來拓展那些未能培養的微生物遺傳資源的應用。未來採樣會擴及瘤胃內容物、厭氣沉積物、活性污泥，如此一來厭氣與好氣的微生物都被網羅了進來，種類也會涵蓋古細菌、細菌、真菌及原蟲。
雖然畜產環境屬於人工馴化的狀態，然而許多研究指出，這類樣品中所含有目前技術尚未能培養的微生物至少占了85％左右，同樣具有極為吸引人的誘因，值得投入開發。
利用建構多源基因庫找尋有用的新穎基因，雖然是目前較好的方式，但這方面的研究仍有一些技術瓶頸有待解決，而且也需要自動化的挑菌落設備、保存的設施及快速篩選的平臺。目前，畜產試驗所已有這方面的儀器設備可供利用，但研究人員尚嫌不足，希望未來能找到相關的研究機構，共同開發這一領域所潛藏的寶藏。
