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畜產生物科技:正番鴨生菜鴨–生殖系嵌合家禽

92/12/10 瀏覽次數 12028
別小看了一個雞(鴨)蛋

基因農場的概念,已引起動物生產者,對利用動物生產高價值的人類藥用蛋白質,產生濃厚的興趣。而家禽是否也能在基因農場中扮演一個要角呢?相信雞或鴨以後也會有機會說一聲:雖然我很小,但是我的「生產力」絕不會落在牛、羊之後!這是為什麼呢?因為利用家禽作為藥用蛋白質或抗體的生物工廠,有其先天上的優勢。

首先,家禽的世代間距短,每隻雞年產約250~300個蛋,大量繁殖轉殖家禽比大動物來得容易,而且每一個蛋的蛋白中含三公克以上的蛋白質,每個蛋黃所含免疫球蛋白可達四百毫克,生產成本較低;其次,更因為蛋白或蛋黃中,蛋白質純化的過程也相當清楚, 而且用雞胚來生產疫苗供人類使用已實施多年,在人畜間共同傳染的生物安全性控制上已十分完備,因此禽蛋是一種理想的藥用蛋白質來源。一些生技公司也開始研究,如何以家禽作為基因轉殖的對象,以生產各類昂貴的藥用蛋白質或抗體。

雖然動物基因轉殖的研究工作,自始即受到重視,而且也獲致了重大的進展,但是家禽基因改造的相關技術,至今尚未十分成熟,這是由於卵形成過程複雜,而且受精卵的最早期發育是在卵管內進行,待排出體外時,已分裂成三萬至六萬個細胞(胚盤)。也就是說,自公雞的精子與母雞的卵,在母雞的卵管內結合,完成受精過程後,會繼續進行細胞分裂,形成多個細胞構成的胚盤。因為如果要生產具繁殖性的基因轉殖動物,只有把基因放入未分裂的受精卵或是生殖細胞內才有可能。所以要直接對尚未分裂的單一受精卵,做基因注入十分困難。

最近十年來,在家禽胚操縱技術上獲致的一些突破,使得家禽基因轉殖變得可行性相當高。這些重要的技術包括了:雞胚胎體外培養系統的建立,以及利用生殖腺中含有不同個體的生殖系細胞,生產生殖系嵌合家禽,這些都是建立基因轉殖途徑的相關技術。生殖系嵌合家禽的產製有兩種方法,其中之一為利用生殖細胞的原始細胞系–始基生殖細胞的轉移來達成,或是利用早期胚盤內的胚葉細胞的轉移來達成。

始基生殖細胞

一個受精雞蛋被母雞排出體外時,它的發育階段是處於耶爾基勒迪(Hefzibah Eyal-Giladi)及柯查夫(Shimshou Kochav)兩位學者所提出的X階段。此一階段的胚盤中央有一個透明圓形區,稱為透明區,由一不含蛋黃的液腔在下方支撐,其四周則為一不透明的白色環帶,稱為不透明區。不透明帶與蛋黃有接觸面,當孵化開始後,透明區會分化成兩層,上層為外胚層,以後會發育成胚胎,下層為下胚層,以後會發育成胚胎外膜。

部分下胚層會變成所謂的卵新月區,也就是家禽的始基生殖細胞,在發育過程中首度被辨識出來的位置。隨後,始基生殖細胞會由卵新月區移到生殖脊,此一移行過程主要是藉由胚胎的胚體內與胚體外血液循環而達成,或由血液中的始基生殖細胞,主動離開血管移行至原始性腺而形成,其間可能牽涉到一些性腺釋放的化學物質及某些物理因素的影響。

由於家禽始基生殖細胞,由X階段胚胎逐漸發育至到達生殖脊位置的過程,具有在血液中移行的特殊現象,因此可在其移行途中將之取出,或是自生殖脊中將細胞取出,並分離出始基生殖細胞。再將此類細胞移置到另一胚胎中,而這些被移入的始基生殖細胞,就會隨血流再度移行到生殖脊中,便可得到具生殖系嵌合的嵌合體。如將這些始基生殖細胞在注入接受者之前,先把所欲轉殖的外源性基因,利用各種基因轉殖的方法放入始基生殖細胞中,再做始基生殖細胞的轉移,則有機會獲得生殖細胞中具有基因轉殖的家禽。

世界第一隻始基生殖系嵌合鴨

以鴨為例,究竟如何利用始基生殖細胞的轉移生產生殖系嵌合鴨,並作為基因轉殖的途徑。首先,將提供始基生殖細胞鴨種,孵化約4~5天的受精蛋,在顯微鏡下自背大動脈採血,並分離出始基生殖細胞,再將這些始基生殖細胞,注入另一隻接受者鴨胚胎(同時孵化至5~6天)的背大動脈,然後進行孵化;另一途徑則是自孵化至7~9天(依鴨種而異)的始基生殖細胞供應鴨胚中取出性腺,分離出始基生殖細胞後,注入另一始基生殖細胞接受鴨的胚胎中再進行孵化。

從始基生殖細胞自胚胎取出,到注入另一鴨胚胎之前,可以進行外源性基因的轉染,而導入所欲得到的外源性基因,經篩選後選取轉染成功的始基生殖細胞,再注入接受鴨胚,以便獲得帶有外源性基因的嵌合鴨。

經上述始基生殖細胞注入而孵化出來的雛鴨,必須將其飼養至性成熟,並以人工配種的方式來測試其是否為生殖系嵌合鴨,亦即所孵出的鴨必須與另一品種的鴨進行人工授精,並以其所孵出的後代來判定該鴨是否為一生殖系嵌合鴨。

正常情況下,一隻公正番鴨(Muscovy Duck; Cairina moschata)與母菜鴨配種之後,只會生出土番鴨雛鴨(公正番鴨 × 母菜鴨),但是若能生出菜鴨後代,則表示此公正番鴨的精子中,混有來自菜鴨始基生殖細胞所形成的精子,如此一來即可斷定此一公正番鴨為一生殖系嵌合公鴨。如果它是一母正番鴨,在與菜鴨公鴨配種之後,正常情況下只會生出鴃騠鴨(公菜鴨 × 母正番鴨),但是若能生出純種菜鴨雛鴨,即表示此母正番鴨的性腺已成功嵌入菜鴨的始基生殖細胞,為一生殖系嵌合母鴨。

畜產試驗所與成大生科所合作,已成功地得到世界第一隻經菜鴨始基生殖細胞轉移成功的公正番鴨,它的後代中有16%為菜鴨。透過這隻生殖系嵌合公正番鴨所生的不同後裔表型,我們可以正確地區分出它們是否來自注入的始基生殖細胞。如果在注入接受胚胎之前的始基生殖細胞是經過基因轉染處理時,則這隻生殖系嵌合公正番鴨所生的菜鴨就可能帶有外源基因,可以進一步地測定該菜鴨遺傳組成中外源性基因的嵌入或表現,便可獲知是否為一基因轉殖家禽。

胚葉細胞轉移

除利用始基生殖細胞轉移,生產生殖系嵌合體家禽外,另有研究者曾以家禽胚胎發育至X階段的胚葉細胞的轉移,來獲得生殖系嵌合體。將供應胚葉細胞家禽(如土雞)的受精蛋,以無菌濾紙環或微量吸管,吸取胚胎中央透明區部位的胚葉細胞,經處理後進行基因轉殖。將轉殖過的細胞,以微量注入針,注入另一已事先做輻射處理或抽掉部分胚葉細胞的接受者(如來亨雞)的胚盤透明區下腔中,封好蛋殼後繼續孵化,孵出的小雞表型可能為來亨雞毛色,也可能為混有土雞毛色的體細胞嵌合情形,飼養至性成熟後,以人工配種來測試其是否為生殖系的嵌合體。

其測定與上述生殖系嵌合鴨原理相似,當此一來亨雞為生殖系嵌合體時,其所產生的生殖細胞會有兩類,一為具來亨雞遺傳組成的生殖細胞,另一則為具土雞遺傳組成的生殖細胞,當它們與測試用土雞的精子或卵結合時,會有兩種情形的毛色,由於來亨雞白色羽毛的基因型為II,而土雞的毛色則為ii,I基因為不完全顯性,所以Ii (來亨雞與土雞的雜交)則為白色羽毛但會有顏色的斑點。若產生土雞毛色後代,則表示受測試雞為一生殖系嵌合雞,便可以更進一步測定此一土雞雛雞的基因,是否帶有轉殖的外源性基因,而確定是否有基因轉殖。

以胚葉組織進行生殖系嵌合體的產製時,由於胚葉細胞容易取得,短時間內即可完成準備工作,但是若以始基生殖細胞為轉移細胞,在技術上則困難許多,且取得的細胞數量較少,不易作外源性基因的轉殖,或遺傳組成修正處理等操作。由於胚葉細胞可以大量取得,且與螢光激發細胞分離技術配合使用時,可以讓轉染細胞帶有螢光,再經由螢光激發細胞分離儀器分離後,可將帶有螢光的細胞挑選出來,而達到篩選的目的。此一方法與始基生殖細胞的轉移一樣,孵化率皆不高,約在5~15%之間,如果採取體外培養系統,孵化率可提高到30%。

朝體外長期培養方向努力

不論以始基生殖細胞或胚葉細胞的移轉來生產生殖系嵌合體,作為家禽基因轉殖的途徑時,這些作為媒介的始基生殖細胞或胚葉細胞,如果能做體外長期培養,則對生殖系嵌合體的生產效率及基因轉殖的效率都將獲得改善。如此一來,可以省去自胚胎性腺或血液中取得始基生殖細胞的困難過程,而且可以有足夠的時間,篩選出外源性基因轉殖成功的細胞,以供轉移之用,若能如此,必然會顯著地改善基因轉殖的成功率。

當我們對家禽性腺中的始基生殖細胞的起源及其分化過程越清楚時,就更有可能進行體外培養,對我們如何利用始基生殖細胞或胚葉細胞中始基生殖細胞的前身細胞,作為基因轉殖途徑,就更讓人樂觀。目前已經可以利用培養了48小時的胚葉細胞,來生產生殖系嵌合體,雖然利用基因轉殖過的胚葉細胞,尚未有形成生殖系嵌合體的報告出現,但是此一結果相信為期不遠矣!
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